AM真菌的分类鉴定是进行其他相关研究的重要基础, 对于认识AM真菌及菌种资源保护具有重要的意义。在AM真菌的研究初期, 研究者多是根据孢子形态、菌丝侵染和产孢方式等特征对AM真菌进行分类鉴定^{[23, 24]}。但由于受多种因素如地理差异、宿主植物不同等的影响, 同一种AM真菌的孢子形态特征可能会具有较大的差别, 这就会给菌种鉴定工作带来困难, 在进行分类时易产生混乱^{[25, 26, 27]}。近年来, 随着当代分子生物学技术的发展, 在菌种鉴定及分类地位中逐步引入分子生物学研究方法, 基于核酸分析, 运用分子鉴定技术对AM真菌进行系统分类, 使AM真菌的分类更具科学性和准确性, 推动AM真菌群落研究及其自然分类系统的建立和完善^{[28, 29, 30]}。目前, 18S rDNA测序技术、rRNA核苷酸序列分析、ITS序列分析、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)等现代分子生物学技术均被广泛用于丛枝菌根真菌的分类和鉴定工作中^{[31, 32, 33]}。如Redecker等^[31]结合PCR-ITS-RFLP技术, 对Glomus sinuosum和Sclerocystis coremioides两种AM真菌的PCR扩增产物进行RFLP分析, 构建系统发育树, 进行分子发育分析。一般采用分子生物学技术鉴定AM真菌种类, 是直接从样品中提取DNA作为模板, 采用AM真菌的特异性引物进行PCR扩增, 再通过电泳分离扩增的片断或者采用其他的分子标记技术, 对不同丛枝菌根真菌的扩增产物进行序列比对, 从而确定真菌种类(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 AM真菌的分类鉴定 Table 1 AM fungi classification and identification 寄主植物 Host plant 试验方法 Testing method AM真菌 AM fungi 引物名称 Primer pair 扩增片段大小 Fragment size/bp 参考文献 Reference 韭葱 Alliium porrum 18S rDNA测序技术 18S rDNA Sequencing techniques rRNA核苷酸序列分析 rRNA Nucleotide sequence analysis 泡囊球囊霉 Glomus vesiculiferum SS38-NS21 VANS1-NS21 600 550 [32] 根内球囊霉 G. intraradices SS38-NS21 VANS1-NS21 600 550 珠状巨孢囊霉 Gigaspora margarita SS38-NS21 VANS1-NS21 600 550 胡杨 Populus euphratica 巢式PCR Nested-PCR 摩西球囊霉 G. mosseae LR1-FLR2 LR1-NDL22 - 750 [34] 黄檗 Phellodendron amurense 巢式 PCRNested-PCR 根内球囊霉 G. intraradices ITS1-NDL22 LR1-NDL22 - 761 [35] 摩西球囊霉 G. mosseae ITS1-NDL22 LR1-NDL22 - 787 美丽盾孢囊霉 Scutellospora calospora ITS1-NDL22 LR1-NDL22 - 742 变形球囊霉 G. versiforme ITS1-NDL22 LR1-NDL22 - 776 草莓 Fragaria ananassa ITS序列分析 Internal transcribed spacer sequence analysis 嗜松青霉 Penicillium pinophilum ITS1-ITS4 544 [36]

表1 AM真菌的分类鉴定 Table 1 AM fungi classification and identification

AM真菌检测的常规方法是基于形态学观察, 如采用曲利苯蓝对被AM真菌侵染的植物组织进行染色, 观测植物根皮层的丛枝(arbuscules)和泡囊(vesicles)结构, 从而检测出AM真菌是否侵染寄主植物^[37]。但AM真菌种类众多, 且具有一定的地域独特性, 所以在寄主植物根内的解剖学结构及形态特征上存在很大差异^{[38, 39]}。另外, 在实际研究工作中发现, 一种AM真菌可以侵染多种植物并定殖于其根部, 而同一种植物根系内也可能同时存在多种AM真菌^[40]。因此, 当几种AM真菌同时感染同一植物根段时, 要想采用这种传统方法准确检测某一种具体的AM真菌对植物根系的侵染并不容易, 这给有关研究工作带来了极大困难。

近年来, 国内外学者在利用分子生物学方法检测AM真菌对寄主植物的侵染方面取得了较大进展。通过分析核糖体DNA序列, 设计出了AM真菌种或属水平的特异性引物, 从而使准确检测AM真菌得以实现^{[41, 42]}。这种方法主要是通过提取AM真菌定殖的植物根段或孢子内的真菌DNA, 运用PCR技术和AM真菌特异性引物进行扩增, 从而对AM真菌进行特异性检测^{[43, 44]}。经多项试验验证发现, 实时定量PCR (qPCR)可以准确、快速地实现AM真菌的检测, 根内球囊霉(G. intraradices)是最常见的丛枝菌根真菌之一, 被广泛应用于农业生产及自然土壤修复等方面。而从中分离的DAOM-197198作为一种商业接种物, 具有极其重要的生态和经济价值。但是如何量化AM真菌模型的孢子, 检测是否准确分离到DAOM-197198, 一直以来是该研究领域未解的难题。Badri等^[45]从14个完整的AM真菌线粒体基因组序列中, 通过在单拷贝cox3-rnl基因区间设计的水解探针进行qPCR检测, 并进行了验证, 准确地量化了分离所得DAOM-197198的孢子。使用标准PCR和qPCR进行特异性检测, 结果表明, 引物特异性扩增了分离的DAOM-197198, 产生106 bp的PCR产物, 平均每个孢子mt基因的拷贝数为3 172 (n=6), 这充分显示了利用qPCR技术检测AM真菌的准确性、精确度及其重现性。qPCR作为一种新兴的科学技术, 如何将其发展成为一种经过严格验证的质量控制手段, 从而可以保证实际的生产需求, 实现产业化应用, 是目前众多学者进行相关研究的最终目标。

郑世学等^[46]运用特异性分子探针和nested-PCR技术, 从田间接种AM真菌摩西球囊霉(G. mosseae)和根内球囊霉的玉米(Zea mays)根样中提取DNA进行特异性扩增, 成功地从感染根段中检测到了接种的AM真菌, 证明摩西球囊霉和根内球囊霉都可以侵染玉米根系。2004年在番茄(Lycopersicon esculentum)根系中同样检测到了这两种AM真菌^[47]。为了迅速而又准确地探测到自然生态系统中的多种AM真菌对植物的侵染, 董秀丽和赵斌^[48]在研究中首次将多重PCR与嵌套PCR结合起来研究田间AM真菌区系, 即在一个反应体系中, 同时加入多种AM真菌种水平上的特异性引物, 用于探测自然界中多种不同植物的AM真菌区系, 这种检测方法具有高度敏感性, 准确率高达95%(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 AM真菌的检测 Table 2 AM fungi detection 寄主植物 Host plant 环境条件 Environmental conditions 检测方法 Detection method AM真菌 AM fungi 引物名称 Primer pair 扩增片段大小 Fragment size/bp 参考文献 Reference 玉米 Z. mays 田间 Field 巢式PCR Nested-PCR 摩西球囊霉 G. mosseae LR1-NDL22 LR1-8.22 5.25-NDL22 747 - 372 [46] 根内球囊霉 G. intraradices LR1-NDL22 LR1-8.22 5.25-NDL22 742 455 - 番茄 L. esculentum 盆栽 Pots 巢式PCR Nested-PCR 摩西球囊霉 G. mosseae LR1-NDL22 LR1-8.22 5.25-NDL22 747 - 372 [47] 根内球囊霉 G. intraradices LR1-NDL22 LR1-8.22 5.25-NDL22 742 455 - 紫云英 Astragalus sinicus 田间 Field 嵌套多重PCR Nested multiplex PCR 摩西球囊霉 G. mosseae LR1-NDL22 5.25-NDL22 8.22-LR1 747 372 - [48] 根内球囊霉 G. intraradices LR1-NDL22 5.25-NDL22 8.22-LR1 747 - 455 黄檗 P. amurense 林场 Forest farm 巢式PCR nested-PCR 根内球囊霉 G. intraradices ITS1-NDL22 8.22-LR1 747 455 [35] 摩西球囊霉 G. mosseae ITS1-NDL22 5.25-NDL22 747 372 美丽盾孢囊霉 S. calospora ITS1-NDL22 S.cal-LR1 747 718 变形球囊霉 G. versiforme ITS1-NDL22 G.ver-LR1 747 - 胡杨 P. euphratica 极端干旱区 Extremely arid area 巢式PCR nested-PCR 摩西球囊霉 G. mosseae LR1-NDL22 5.25-NDL22 750 370 [34]

表2 AM真菌的检测 Table 2 AM fungi detection

AM真菌是生态系统中生物多样性的重要组分之一, 具有十分丰富的物种多样性、遗传多样性和功能多样性。AM真菌属球囊菌门, 包括1个纲4个目13个科19个属, 这是目前最新的分类系统, 由Redecker等^[49]于2013年整理完善。

AM真菌生态适应性强, 几乎存在于自然界的各个生境中, 种质资源十分丰富^{[50, 51]}。其宿主范围亦十分广泛, 绝大多数植物包括被子植物、裸子植物、蕨类、苔鲜等都可不同程度地被AM真菌侵染^[52], 而寄主植物的多样性在一定程度上决定了AM真菌的多样性。了解AM真菌的多样性不仅具有理论价值, 而且有重要的经济意义。通过分子生物学方法检测AM真菌物种丰富度及生物多样性, 可以了解AM真菌群落组成结构、多样性及其种属间的差异, 掌握其在不同耕作土壤类型中的分布特点, 筛选优势菌株, 优化菌根植物互利共生体系, 为菌根技术的应用准备基础菌种资源和技术基础。目前, 随着分子生物学科的不断完善, 众多分子生物学技术开始应用到AM真菌物种多样性的研究上^{[53, 54]}, 并发挥着越来越大的作用(表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 AM真菌群落多样性 Table 3 AM fungi community diversity 寄主植物 Host plant 试验方法 Testing method AM真菌 AM fungi 引物名称 Primer pair 扩增片段大小 Fragment size/bp 参考文献 Reference 小麦 Triticum aestivum q-PCR 球囊霉目Glomerales AMV4.5NF-AMDGR - [55] 多孢囊霉目Diversisporales AMV4.5NF-AMDGR - 类球囊霉目Paraglomerales AMV4.5NF-AMDGR - 新球囊霉属Claroideoglomus AMV4.5NF-AMDGR - 绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum 巢式PCR Nested-PCR 黏质球囊霉 G. viscosum AML1-AML2 NS31-AM1 800 550 [56] 幼套球囊霉 G. etunicatum AML1-AML2 NS31-AM1 800 550 Racocetra tropicana AML1-AML2 NS31-AM1 800 550 刺无梗囊霉 Acaulospora spinosa AML1-AML2 NS31-AM1 800 550 蜜色无梗囊霉 A. mellea AML1-AML2 NS31-AM1 800 550

表3 AM真菌群落多样性 Table 3 AM fungi community diversity

多项研究表明, AM真菌与植物共生可以促进宿主对矿质元素的吸收, 改善宿主的营养状况(表4)。例如AM真菌可以有效缓解植物根际的养分匮乏现象, 促进磷的吸收利用。研究发现, 珠状巨孢囊霉(G. margarita)与紫云英(A. sinicus)共生可以诱导磷转运蛋白基因如GigmPT、AsPT1和AsPT4的表达^[57]。在AM共生体中, AM真菌可以依靠细胞膜上的磷转运蛋白将土壤中的无机磷酸盐(主要是H₂P O4-形式的正磷酸盐)转运到根外菌丝中, 然后再借助AM特异性的植物磷酸转运蛋白将质外体内的游离态磷酸盐转运到植物的皮层细胞, 将其运输进入寄主体内^[64]。更重要的是, AM真菌还可以从土壤中吸收多聚磷酸盐, 并通过多聚磷酸酶将其转化为正磷酸盐, 有利于植物吸收利用^[65]。有研究者推测, AM共生体之所以可以特异性诱导植物磷酸转运蛋白基因的表达, 是因为AM中可能存在着一种参与丛枝形成的细胞信号物质可以激活此类基因的表达^[66]。例如, Drissner等^[67]发现, 在AM共生体中存在一种名为溶血卵磷脂的物质, 它可以特异性诱导番茄中磷转运蛋白基因的表达。番茄中的磷酸转运蛋白基因如LePT4、LePT5, 这两个基因在植物体与根内球囊霉形成AM共生体后可以被特异性的激活表达^[58]。水稻(Oryza sativa)接种苏格兰球囊霉(G. caledonium)、光壁无梗囊霉(A. laevis)、摩西球囊霉等AM真菌可以特异性诱导植物体内的磷转运蛋白基因OsPT11的表达^[59]。珠状巨孢囊霉可以诱导日本百脉根(Lotus japonicus)中磷酸转运蛋白LjPT4特异性表达^[60]。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 宿主植物养分吸收 Table 4 Host plants nutrient uptake 寄主植物 Host plant AM真菌 AM fungi 试验条件 Experimental conditions 试验方法 Experimental method 作用机制 Mechanism 参考文献 Reference 紫云英 A. sinicus 珠状巨孢囊霉 G. margarita 盆栽 Pots RT-PCR qRT-PCR 诱导磷转运蛋白基因GigmPT、AsPT1和AsPT4表达 Induced phosphate transport protein genes include GigmPT, AsPT1 and AsPT4 expression [57] 番茄 L. esculentum 根内球囊霉 G. intraradices 盆栽 Pots q-PCR 特异性调控磷酸盐转运蛋白基因LePT4、LePT5表达 Specifically regulated phosphate transporter protein genes LePT4 and LePT5 expression [58] 水稻 O. sativa 苏格兰球囊霉 G. caledonium 光壁无梗囊霉 A. laevis 摩西球囊霉 G. mosseae 温室 Glass house RT-PCR 诱导磷转运蛋白基因OsPT11特异性表达 Induced phosphate transporter protein gene OsPT11 specific expression [59] 日本百脉根 L. japonicus 珠状巨孢囊霉 G. margarita 发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes 盆栽 Pots qRT-PCR 诱导磷酸转运蛋白LjPT4特异性表达 Induced phosphate transporter protein LjPT4 specific expression [60] 紫云英 A. sinicus 珠状巨孢囊霉 G. margarita 盆栽 Pots 末端克隆技术 Rapid-amplification of cDNA ends (RACE), RT-PCR 抑制锌转运蛋白基因AsZIP2的表达 Inhibited zinc transporter protein gene AsZIP2 expression [61] 蒙古扁桃 A. mongolica 摩西球囊霉 G. mosseae 盆栽 Pots qRT-PCR 高通量测序 High-throughput sequencing 上调C4固定路径相关基因的表达, 下调氮转运蛋白基因的表达 Up-regulated genes related to C4 fixed route expression, and down-regulated nitrogen transporter protein genes expression [62] 小麦 T. aestivum 摩西球囊霉 G. mosseae 幼套球囊霉 G. etunicatum 根内球囊霉 G. intraradices 盆栽 Pots RT-PCR 下调根内氮转运蛋白基因NRT、NAR和AMT的表达 Downregulated nitrogen transporter protein genes include NRT, NAR and AMT expression [63]

表4 宿主植物养分吸收 Table 4 Host plants nutrient uptake

土壤中锌的缺乏会导致作物产量及品质的降低, 这已成为农业生产中普遍存在的问题。韩亚超等^[61]选取ZIP家族Zn转运基因AsZIP2, 利用RT-PCR与定量PCR方法检测紫云英与珠状巨孢囊霉共生时AsZIP2基因的表达, 发现AM真菌的侵染强烈地抑制了AsZIP2的表达, 而施加Zn会诱导AsZIP2的表达, 这说明ZIP家族蛋白质可以促进植物对Zn的吸收, 对缓解植物缺锌起着关键作用。

AM真菌影响宿主植物养分吸收不全表现为正效应, 也有研究发现AM真菌会下调相关基因表达, 抑制养分吸收。如摩西球囊霉与蒙古扁桃(Amygdalus mongolica)共生可以提高C₄固定路径相关基因的表达, 降低氮转运蛋白基因的表达^[62]。段建锋等^[63]对小麦(T. aestivum)接种摩西球囊霉等AM真菌, 发现下调了植物根内氮转运蛋白基因NRT、NAR和AMT的特异性表达。

AM真菌可以通过调节胁迫诱导基因的表达, 抵御包括干旱、盐碱、渗透压等在内的不利环境因素(表5)。例如HOG1基因, 它是一个与抵御高渗透压环境相关的基因, 这已在多个物种中均有报道^{[76, 77]}。根内球囊霉与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)共生, 盐胁迫条件下, 接菌植株中基因R.i HOG1的表达量较未接菌的对照植株提高了2倍, 这说明根内球囊霉促进了基因R.i HOG1的表达, 增强了寄主植物抵抗渗透压胁迫的能力^[78]。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 宿主植物抗逆蛋白及转运蛋白基因表达 Table 5 Host plant anti-inulin and transporter gene expression 寄主植物 Host plant AM真菌 AM fungi 试验条件 Experimental conditions 试验方法 Experimental method 作用机制 Mechanism 参考文献 Reference 水稻 O. sativa 苏格兰球囊霉 G. caledonium 光壁无梗囊霉 A. laevis 摩西球囊霉 G. mosseae 温室 Glass house RT-PCR 诱导糖转运蛋白基因OsMST4、OsMST7特异性表达 Induced sugar transporter protein genes OsMST4 and OsMST7 specific expression [63] 豌豆 P. sativum 地表球囊霉 G. versiforme 生长室 Growth chamber RT-PCR 诱导PsNlec1基因表达 Induced expression of PsNlec1 gene [68] 蒺藜苜蓿 M. truncatula 根内球囊霉 G. intraradices 盆栽 Pots Rapid-amplification of cDNA ends(RACE) qRT-PCR Host-induced gene silencing (HIGS) Rho家族蛋白维持共生关系建成 Rho family proteins maintained symbiotic relationship built [69] 甜瓜 C. melo 摩西球囊霉 G. mosseae 盆栽 Pots RT-PCR 诱导编码P5CS的基因MeP5CS表达 Induced the gene MeP5CS coded P5CS expression [70] 酸枣 Z. jujuba 摩西球囊霉 G. mosseae 营养钵 Nutrition pot cDNA-AFLP 诱导盐胁迫应答基因表达 Induced salt stress response genes expression [71] 紫穗槐 A. fruticosa 摩西球囊霉 G. mosseae 盆栽 Pots 二维液相串联质谱 (SCX-RPLC-MS/MS)Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ) 诱导代谢、能量、信号转导、蛋白合成、细胞结构、胁迫和防御等相关蛋白差异性表达 Induced expression of proteins related to metabolism, energy, signal transduction, protein synthesis, cell structure, stress and defense [72] 紫穗槐 A. fruticosa 摩西球囊霉 G. mosseae 根内球囊霉 G. intraradices 盆栽 Pots 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 菌根共生相关蛋白的数目增加 Increased the number of mycorrhizal symbiosis-related protein [73] 番茄 L. esculentum 根内球囊霉 G. intraradices 温室 Glass house 基因芯片分析 Gene chip analysis 上调miRNA蛋白的表达量 Increased miRNA protein expression [74] 紫穗槐 A. fruticosa 摩西球囊霉 G. mosseae 盆栽 Pots mRNA差异显示技术 mRNA DD-PCR, mRNA differential display PCR 植株是否接种AM间具有差异条带 There were different stripes when plants inoculated AM fungi or not [75]

表5 宿主植物抗逆蛋白及转运蛋白基因表达 Table 5 Host plant anti-inulin and transporter gene expression

同样, 还有多项研究表明AM真菌可以影响糖转运蛋白基因的特异性表达。Balestrini等^[68]发现, 地表球囊霉(G. versiforme)可以诱导豌豆(Pisum sativum)中PsNlec1基因的特异性表达, 这种基因可以编码凝集素糖蛋白的合成。另有研究发现, 根内球囊霉可以特异性上调番茄体内糖转运蛋白基因LeST3的表达, 而近明球囊霉(G. claroideum)则下调此基因的表达。这两种AM真菌均可以特异性诱导水稻中糖转运蛋白基因OsMST4和OsMST7的表达^[63]。

另外, AM真菌还可以影响植物体其他多种基因的表达。根内球囊霉与蒺藜苜蓿共生可以促进Rho家族蛋白的表达, 这类蛋白与共生关系的建立密切相关, 如RiRho1蛋白可能与丛枝菌根真菌的萌发及定向生长有关, 而RiCDC42蛋白则与附着胞形成及侵入栓的形成有关^[69]。黄志等^[70]发现, 甜瓜(Cucumis melo)与摩西球囊霉共生可以诱导编码P5CS的基因MeP5CS的表达。在对酸枣(Ziziphus jujuba)^[71]和紫穗槐(Amorpha fruticosa)^[72]的研究发现, AM真菌还可以诱导代谢相关蛋白、能量相关蛋白、信号转导蛋白、蛋白合成相关蛋白、细胞结构蛋白、胁迫和防御相关蛋白等的差异性表达。

分子生物学技术已广泛应用于植物-微生物互作, 对于AM真菌而言, 有关AM共生体的研究已涉及较深层次的分子层面, 且取得了较大进展, 为后续进一步揭示AM真菌调控共生关系建立和维持的分子机制打下基础, 但传统的形态学、生物学、生态学及生理生化等研究技术同样重要, 正是由于这些传统的研究方法, 促进了人们对AM真菌的认知, 引发了国际上诸多学者对AM真菌研究的热情, 推动了菌根学的形成。当前, AM真菌的研究应注重传统方法与分子生物学技术的结合, 如在分类鉴定中, 有效利用形态学、显微技术、生物学、代谢学及现代分子生物技术, 使得分类系统逐步完善, 分类方法更加科学。在AM真菌功能多样性和遗传多样性方面, 亦应加强生物学、生态学与分子生物学技术的结合, 从宏观、微观尺度解析AM真菌功能多样性。在AM真菌资源利用方面, 充分发挥我国生物多样性高, AM真菌资源丰富的特点, 通过高通量、转录组、宏基因组等分子生物技术、蛋白组学、显微技术与生物学、生态学等传统方法结合, 充分发挥AM真菌在生态环境建设与农业可持续发展中的作用, 减少化肥农药施用, 推进绿色、可持续发展, 实现乡村振兴战略。

(责任编辑 王芳)