引用本文
曹莹, 姚祥, 陈水红, 李春杰. 甲基托布津对野大麦内生真菌共生体的生长及生理生化的影响. 草业科学, 2018,35(2):323-330
Cao Ying, Yao Xiang, Chen Shui-hong, Li Chun-jie. Effect of thiophanate methyl on the growth and physiological and biochemical characteristics of Hordeum brevisubulatum-Epichloë bromicola symbionts . Pratacultural Science,2018,35(2): 323-330  
Doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0128
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甲基托布津对野大麦内生真菌共生体的生长及生理生化的影响
曹莹, 姚祥, 陈水红, 李春杰
草地农业生态系统国家重点实验室 农业部草牧业创新重点实验室 兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020
通信作者:李春杰(1968-),男,甘肃镇原人,教授,博导,博士,研究方向为禾草-内生真菌共生体。E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

第一作者:曹莹(1991-),女,甘肃张掖人,在读硕士生,研究方向为禾草-内生真菌共生体。E-mail:caoy15@lzu.edu.cn

收稿日期: 2017-07-28
基金: 国家重点基础研究发展规划(“973”计划)(2014CB138702); 国家自然科学基金(31372366); 长江学者和创新团队发展计划资助(IRT_17R50); 中央高校基本科研业务费(lzujbky-2016-bt10、lzujbky-2017-kb11); 111引智基地(B12002)
摘要

以我国北方优良耐盐牧草野大麦( Hordeum brevisubulatum)为研究对象,进行了杀菌剂甲基托布津对野大麦内生真菌共生体的生长及生理生化影响的研究。结果表明,甲基托布津稀释500倍浸泡种子8 h后播种,出苗率显著降低( P<0.05),从85%降至72%,幼苗带菌率显著降低( P<0.05),由100%降至12%;杀菌剂处理可降低野大麦的株高、分蘖,但对其叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性和超氧化物酶活性均未产生显著影响( P>0.05);杀菌剂处理后野大麦的C、N、P含量较蒸馏水浸种对照分别显著降低了4.87%、10.99%、13.50%( P<0.05)。因此,甲基托布津稀释500 倍浸泡种子8 h为去除野大麦种传内生真菌的有效办法。

关键词: 内生真菌; 野大麦; 内吸性杀菌剂; 出苗率; 带菌率
中图分类号:S512.901;Q945.79 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2018)02-0323-08
Effect of thiophanate methyl on the growth and physiological and biochemical characteristics of Hordeum brevisubulatum-Epichloë bromicola symbionts
Cao Ying, Yao Xiang, Chen Shui-hong, Li Chun-jie
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, Gansu, China
Corresponding author: Li Chun-jie E-mail:chunjie@lzu.edu.cn
Abstract

Hordeum brevisubulatum, a salt-tolerant forage grass species in northern China, was studied to explore the impact of thiophanate methyl on the growth and physiological and biochemical characteristics of endophytic fungi within the wild barley. Results showed that the rate of emergence decreased significantly, from 85% to 72%, after sown seeds were treated with a 500× dilution of thiophanate methyl for 8 h ( P<0.05), and the seedling carrier rate decreased significantly from 100% to 12% ( P<0.05). Fungicide treatment reduced plant height and tillers of wild barley, whereas chlorophyll, malondialdehyde, and proline content and catalase, peroxidase, and superoxide enzyme activity were not significantly affected ( P>0.05), C, N, and P content of wild barley decreased by 4.87%, 10.99%, and 13.50%, respectively, after fungicide treatment, compared with that in the control group ( P<0.05). Therefore, treatment of seeds with 500× diluted thiophanate methyl for 8 h was an effective method to eliminate fungal endophytes in H. brevisubulatum.

Keyword: endophyte; Hordeum brevisubulatum; systemic fungicide; emergence rate; carrier rate

禾草内生真菌[Epichloë endophytes(Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota)]是指在禾草体内渡过全部或大部分生命周期, 而不引致禾草外部症状的一大类真菌[1]。内生真菌与禾草共生, 一方面可提高禾草抗逆性, 例如, 抗旱[2, 3]、耐盐[4, 5, 6]、抗寒[7, 8]等; 另一方面产生次级代谢产物, 合成生物碱, 使草食动物中毒, 影响家畜健康, 例如, 黑麦草(Lolium perenne)内生真菌引起的新西兰绵羊的蹒跚病[9]、醉马草(Achnatherum inebrians)内生真菌引起的家畜中毒症[2, 10]等。因此, 禾草内生真菌共生体对草地生态系统有重要的影响。

野大麦(Hordeum brevisubulatum)是禾本科大麦属的一种多年生优良牧草, 广泛分布于中国北方盐渍草甸, 其质地柔软、多分蘖、产量高和适口性好, 而且耐旱、耐盐碱等, 对环境有较强的适应性[11, 12]。调查研究发现, 生长于甘肃河西走廊盐碱地的野大麦内生真菌带菌率高达100%[13]。陈泰祥等[14]已对野大麦内生真菌的生物学与生理学特性进行了研究, 目前有关内生真菌提高野大麦抗性的研究主要表现在抗虫性[15]、耐涝性[16]、耐盐性[5, 17]、抗旱性[18]等方面。

为了更好地阐明内生真菌禾草共生体的互作关系, 建立不带菌种群显得尤为重要。目前, 已有的去除内生真菌的方法为高温、高湿法[2, 19, 20, 21, 22, 23, 24]和杀菌剂法[25, 26, 27], 但高温、高湿法会不可避免地对宿主植物活力造成不同程度的影响[28]。相比之下, 杀菌剂的除菌效果较好, 但高浓度的杀菌剂也会对种子及幼苗造成一定的伤害[1]。据前人报道甲基托布津稀释500倍液浸泡中华羊茅(Festuca sinensis)种子8 h具有显著杀菌效果而不影响种子萌发, 是剔除中华羊茅种传内生真菌的有效方法[25]; 甲基托布津稀释500倍液浸泡披碱草(Elymus dahuricus)种子6~10 h, 杀菌效果较好, 可有效去除披碱草种传内生真菌[27]。但关于去除野大麦内生真菌的研究未见报道, 近年来, 对野大麦内生真菌共生体已开展了大量的研究工作, 保证E+、E-植株相同的生态背景在研究内生真菌提高宿主抗逆性等方面的影响显得至关重要, 有效去除野大麦内生真菌可消除或减小不同生态地位带来的误差。因此, 本研究在此基础上使用甲基托布津对野大麦内生真菌共生体种子进行处理, 探究该处理条件对野大麦内生真菌共生体的生长及生理生化的影响, 旨在验证甲基托布津稀释500倍液浸种8 h是否对禾本科牧草野大麦的内生真菌剔除同样有效, 为探究该处理浓度和处理时间对剔除禾本科牧草种传内生真菌是否具有普适性提供依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

本研究所需的植物材料野大麦种子, 2014年9月采于甘肃临泽(100° 06' E, 39° 11' N, 海拔1 453 m), 参照李春杰等[29]的方法检测种子带菌率为98%, 种子保存于4 ℃冰箱待用。内吸性杀菌剂为有效成分为70%的甲基托布津, 购买于甘肃种子市场大地农药店。

1.2 试验方法

1.2.1 甲基托布津对野大麦内生真菌共生体的处理 设置甲基托布津稀释500倍液浸种8 h为处理组, 以蒸馏水浸种8 h为对照组, 在浸泡8 h结束后, 用蒸馏水洗去表面残留杀菌剂, 播种于装有800 g经过高温灭菌的营养土和黄土(1∶ 1混匀)的花盆(直径14 cm, 高10 cm)中, 处理组和对照组各种20盆, 每盆播种5粒种子, 置于兰州大学榆中智能温室进行发芽。共计40盆。

1.2.2 各项指标的测定方法 待种子开始发芽后, 进行出苗率指标统计, 待种子出苗6周后进行带菌率检测[29]。出苗60 d后, 每隔10 d进行一次株高和分蘖的形态学生长指标统计, 连续统计4次。出苗100 d后参照李合生[30]的方法进行叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性的测定; 植物有机碳含量采用铬酸氧还滴定法[31]、植物全氮含量采用全自动凯氏定氮仪进行测定(Kjeltec 2300 Auto System Ⅱ , Foss Teactor AB, Sweden)、植物全磷含量采用钼蓝比色法[32]。

1.2.3 统计分析 将试验所得数据用 Microsoft Excel 2007录入并进行常规计算、分析、作图, 采用SPSS 12.0进行统计分析, 单因素采用ANOVA分析, 双因素采用常规线性模型单变量分析。

2 结果
2.1 甲基托布津对野大麦内生真菌共生体出苗率、带菌率及其生长的影响

与对照相比, 经杀菌剂处理过的野大麦出苗率显著降低(P< 0.05), 从85%降至72%。经杀菌剂处理后的野大麦带菌率大幅降低, 从100%降至12%, 差异显著(P< 0.05)(图1)。

图1 500倍甲基托布津处理对野大麦的出苗率和带菌率影响
对照组代表未经杀菌剂处理的野大麦, 处理组代表杀菌剂处理后的野大麦。不同小写字母表示同一指标对照组与处理组的组间差异显著(P< 0.05)。图4同。Fig. 1 Effect of 500× diluted mildothane treatment on the emergence and carrier rates of wild barley
The control group comprised wild barley untreated with fungicide, and the treatment group comprised wild barley treated with fungicide. Different lowercase letters indicate significant difference in the same index between the control and treatment groups at the 0.05 level; similarly for Fig. 4.

对野大麦处理组和对照组进行株高的动态测量, 每一次株高测量组间均出现显著差异(P< 0.05)。结果显示, 该杀菌剂处理可降低野大麦的株高, 出苗60、70、80、90和100 d时杀菌剂处理组的株高分别低于对照4.17、3.49、3.77、3.83和3.49 cm, 且差异显著(P< 0.05)。随着时间的延长, 对照组组内株高没有显著变化, 处理组出苗80 d后组内株高不再显著增长(P> 0.05)(图2)。

图2 500 倍甲基托布津处理对野大麦株高的影响
对照组代表未经杀菌剂处理的野大麦, 处理组代表杀菌剂处理后的野大麦。* 表示对照组与处理组的组间差异显著(P< 0.05), 不同小写字母表示处理组或对照组内不同出苗天数间差异显著(P< 0.05)。图3同。Fig. 2 Effects of 500× diluted mildothane treatment on the height of wild barley
The control group comprised wild barley untreated with fungicide, and the treatment group comprised wild barley treated with fungicide. * indicate significant difference between the control and treatment groups at the 0.05 level, and different lowercase letters indicate significant difference between different days after emergenc in the same group at the 0.05 level; similarly for Fig. 3.

对照组与处理组的分蘖在出苗70、80和100 d时组间出现显著差异(P< 0.05), 60和90 d未出现显著差异(P> 0.05)。组内随时间延长产生显著差异(P< 0.05), 但处理80 d后组内分蘖未出现显著差异(P> 0.05)(图3)。

图3 500 倍甲基托布津处理对野大麦分蘖的影响Fig. 3 Effect of 500× diluted mildothane treatment on the wild barley tiller number

经统计分析, 内生真菌处理对株高影响显著(P< 0.05), 但是不同测量时间对株高影响不显著(P> 0.05), 二者互作对株高无显著影响(P> 0.05); 内生真菌处理和不同测量时间均对分蘖影响显著(P< 0.05), 但是二者互作对分蘖无显著影响(P> 0.05)(表1)。

表1 取样时间以及带菌情况对野大麦生长情况的影响及交互作用 Table 1 Effect of sampling time and endophyte infection on the growth and interactions of wild barley
2.2 甲基托布津对野大麦内生真菌共生体生理指标的影响

经杀菌剂处理后, 野大麦的对照组和处理组之间的叶绿素a和叶绿素b含量均值接近, 未出现显著差异(P> 0.05), 处理组植株中类胡萝卜素含量均值略高于对照组(P> 0.05)。野大麦的处理组植株中丙二醛含量略高于对照组中的含量(P> 0.05)。对照组和处理组的野大麦中脯氨酸含量之间没有显著差异(P> 0.05)。野大麦对照组植株中CAT酶活性略高于处理组(P> 0.05)。对照组野大麦中过氧化物酶活性稍高于处理组(P> 0.05)。野大麦对照组和处理组之间超氧化物歧化酶活性无显著差异(P> 0.05)(表2)。

表2 500倍甲基托布津处理对野大麦内生真菌共生体理指标的影响 Table 2 Effects of 500× diluted mildothane treatment on the physiological indexes of Hordeum brevisubulatum-Epichloë bromicola symbionts
2.3 甲基托布津对野大麦内生真菌共生体营养元素指标的影响

经稀释500倍的甲基托布津杀菌处理后, 野大麦对照组植株中的全碳、全氮和全磷含量均显著高于野大麦处理组植株中的含量(P< 0.05), 与对照组相比, 野大麦处理组植株中C、N和P的含量依次降低4.87%、10.99%、13.50%(图4)。

图4 500 倍甲基托布津处理对野大麦全碳、全氮和全磷含量的影响Fig. 4 Effect of 500× diluted mildothane treatment on C, N, and P content of wild barley

3 讨论与结论

本研究探讨了杀菌剂甲基托布津对野大麦内生真菌的杀菌效果及对野大麦内生真菌共生体的生长及生理生化的影响。目前, 国内外学者利用杀菌剂去除禾草内生真菌, 姚祥等[25]对两种内吸性杀菌剂在不同浓度和时间处理下对中华羊茅种传内生真菌的影响进行了研究, 发现不同稀释倍数的杀菌剂对中华羊茅种传内生真菌有不同的效果; 李娜娜等[26]进行了甲基托布津对醉马草种传内生真菌灭菌活性及种子萌发和幼苗生长影响的研究, 结果表明, 不同稀释浓度的甲基托布津对醉马草种传内生真菌产生的效果不同; 张蕊思[27]研究了杀菌剂对披碱草种子内生真菌的杀菌效果及种子活力的影响发现, 甲基托布津稀释500倍液浸泡种子6~10 h杀菌效果较好; 众多学者研究发现, 用内吸性杀菌剂对多年生黑麦草内生真菌进行杀菌处理, 杀菌效果显著[33, 34, 35]。禾草内生真菌具有较强的宿主特异性, 而不同共生体之间禾草内生真菌的定殖、生长特性差异较大[36]。内生真菌侵染野大麦并与之形成特异性较强的野大麦-内生真菌互惠共生体, 有关杀菌剂对野大麦内生真菌杀菌的研究还未见报道。

本研究以杀菌剂甲基托布津为材料, 其作用机理主要是干扰真菌的有丝分裂中纺锤体的形成, 影响细胞分裂, 起到杀菌作用。作为内吸性杀菌剂, 其性价比高, 对人、畜和植物都很安全[37]。500倍的甲基托布津可使中华羊茅的带菌率从98%降低到10%, 该稀释浓度对中华羊茅处理后, 发芽率、株高和分蘖指标在处理前后无显著差异[25]。甲基托布津浓度为500倍稀释液时, 披碱草种子带菌率为12%左右, 此时灭菌效果要优于其他处理浓度组[27]。本研究与其结果相似, 用500倍甲基托布津处理后, 与对照相比, 经杀菌剂处理后的野大麦带菌率从100%降至12%, 差异显著(P< 0.05)。

本研究使用甲基托布津对野大麦内生真菌共生体种子进行处理, 探究在该条件下对野大麦内生真菌共生体生长及生理生化的影响。结果表明, 500倍的甲基托布津处理降低了野大麦的株高、分蘖, 但随着时间延长, 杀菌剂处理种子出苗80 d后组内株高、分蘖均未出现显著差异(P> 0.05)。Harvey等[34]发现, 使用杀菌剂丙环唑对黑麦草种子进行杀菌处理时, 短时期内种子新长出的幼苗的高度受到抑制, 但这种负作用在植株生长后期逐渐消失, 这与本研究结果较为相似。Siegel等[20]认为, 许多化学农药不能完全杀死高羊茅(Festuca arundinacea)植株体内或种子中的内生真菌, 或者具有真菌毒性作用的同时也对植物有毒害作用。朱丹青等[38]发现叶面施用多效唑对田七(Panax notoginseng)苗期的生理变化存在显著的影响, 显著提高了叶绿素含量、增强了苯丙氨酸解氨酶活性、升高了总黄酮质量分数, 丙二醛含量变化不明显, 总皂苷质量分数降低, 而这些生理变化都会转而影响到植物生长的变化。吴学宏等[39]研究发现, 用2.5%咯菌腈包衣处理西瓜(Citrullus lanatus)种子, 植物体内丙二醛含量下降, 蛋白质含量增加, 并且与对照相比, 过氧化氢酶、过氧化物酶活性显著提高。但是, 众多研究表明, 适宜剂量杀菌剂处理种子后对部分种子幼苗的生长是安全的, 不会影响植物正常的生理活动[40, 41]。本研究发现, 用500倍甲基托布津处理后对植株叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性和超氧化物酶活性均未产生显著影响(P> 0.05)。杀菌剂处理对野大麦的各种生理抗性指标未造成显著影响, 说明该计量杀菌剂处理种子后对植物的生长是安全的, 本身未产生胁迫, 没有对其正常的生理活动造成影响。500倍甲基托布津处理后其营养指标C、N和P水平与对照相比显著降低(P< 0.05)。分析其原因可能是内生真菌在植株体内因代谢活动的需要而增强了共生体的整体代谢水平, 从而增加了共生体对营养元素的吸收和代谢, 使共生体得到了更好的生长而具有更好的营养指标。

本研究发现, 使用70%甲基托布津稀释500倍浸泡野大麦种子8 h的除菌效果良好, 且杀菌剂处理对野大麦的生理抗性指标未产生显著影响。同时, 有研究表明70%甲基托布津作为一种高效低毒的广谱内吸性杀菌剂, 具有保护和治疗作用[42]。因此, 其在生产中使用具有一定优势。

(责任编辑 武艳培)

The authors have declared that no competing interests exist.

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