研究所用的52份老芒麦材料均来自国内, 主要包括品种、栽培材料和野生材料(表1)。其中包括4个栽培品种(同德、青牧1号、川草2号、红原), 18份引种材料由美国农业部提供, 其他材料由兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室, 四川农业大学和四川省草原科学研究院提供。所有的材料按起源地和自然区划可归结为5个地理区域, 分别为青海(QH)、新疆(XJ)、四川(SC)、内蒙古(NM)和甘肃(GS)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验中老芒麦材料的信息 Table 1 Elymus sibiricus accessions used in the study 编号 Code 材料编号 Accession code 来源 Origin 描述 Status 1 同德Tongde 青海 Qinghai 品种 Cultivar 2 PI504462 青海 Qinghai 野生材料 Wild 3 青牧1号Qingmu No.1 青海 Qinghai 品种 Cultivar 4 PI504463 青海 Qinghai 野生材料 Wild 5 PI531669 青海 Qinghai 野生材料 Wild 6 PI499468 新疆 Xinjiang 栽培材料 Cultivated 7 PI499462 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 8 PI619577 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 9 PI595182 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 10 PI499614 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 11 PI499617 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 12 PI499619 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 13 PI595180 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 14 PI655140 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 15 Y2003 新疆 Xinjiang 野生材料 Wild 16 Y1005 四川 Sichuan 野生材料 Wild 17 川草2号Chuancao No.2 四川若尔盖Ruoergai, Sichuan 品种 Cultivar 18 红原Hongyuan 四川红原Hongyuan, Sichuan 品种Cultivar 19 SAU133 四川阿坝 Aba, Sichuan 野生材料 Wild 20 SAU139 四川康定Kangding, Sichuan 野生材料 Wild 21 SAU003 四川康定Kangding, Sichuan 野生材料 Wild 22 SAU137 四川阿坝 Aba, Sichuan 野生材料 Wild 23 SC02 四川若尔盖Ruoergai, Sichuan 野生材料 Wild 24 SC03 四川若尔盖Ruoergai, Sichuan 野生材料 Wild 25 PI499457 内蒙古 Inner Mongolia 栽培材料 Cultivated 26 PI499453 内蒙古 Inner Mongolia 野生材料 Wild 27 PI499456 内蒙古 Inner Mongolia 栽培材料 Cultivated 28 PI499458 内蒙古 Inner Mongolia 野生材料 Wild 29 PI499459 内蒙古 Inner Mongolia 野生材料 Wild 30 W6 614214 内蒙古 Inner Mongolia 野生材料 Wild 31 MQ01 甘肃玛曲Maqu, Gansu 野生材料 Wild 32 HZ01 甘肃合作Hezuo, Gansu 野生材料 Wild 33 HZ02 甘肃合作Hezuo, Gansu 野生材料 Wild 34 HZ03 甘肃合作Hezuo, Gansu 野生材料 Wild 35 XH03 甘肃夏河Xiahe, Gansu 野生材料 Wild 36 XH09 甘肃夏河Xiahe, Gansu 野生材料 Wild 37 XH02 甘肃夏河Xiahe, Gansu 野生材料 Wild 38 XH06 甘肃夏河Xiahe, Gansu 野生材料 Wild 39 LT04 甘肃临潭Lintan, Gansu 野生材料 Wild 40 LT02 甘肃临潭Lintan, Gansu 野生材料 Wild 41 LT05 甘肃临潭Lintan, Gansu 野生材料 Wild 42 LT01 甘肃临潭Lintan, Gansu 野生材料 Wild 43 LQ01 甘肃碌曲Luqu, Gansu 野生材料 Wild 44 LQ03 甘肃碌曲Luqu, Gansu 野生材料 Wild 45 LQ04 甘肃碌曲Luqu, Gansu 野生材料 Wild 46 LQ09 甘肃碌曲Luqu, Gansu 野生材料 Wild 47 LQ10 甘肃碌曲Luqu, Gansu 野生材料 Wild 48 ZHN01 甘肃卓尼Zhuoni, Gansu 野生材料 Wild 49 ZHN05 甘肃卓尼Zhuoni, Gansu 野生材料 Wild 50 ZHN06 甘肃卓尼Zhuoni, Gansu 野生材料 Wild 51 ZHN03 甘肃卓尼Zhuoni, Gansu 野生材料 Wild 52 ZHN04 甘肃卓尼Zhuoni, Gansu 野生材料 Wild

表1 试验中老芒麦材料的信息 Table 1 Elymus sibiricus accessions used in the study

每份材料选取25个幼苗的叶片等量混合, 经冻干处理后采用改进的CTAB法提取DNA^[21]。通过使用Nanodrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对DNA的浓度和质量进行测定。最后, DNA的浓度使用ddH₂O调整为25 ng· μ L^-1用以进一步的分析。

本研究中, 100对EST-SSR引物主要来源于披碱草属、拟鹅观草属(Pseudoroegneria)及赖草属(Leymus)^{[22, 23]}。最终, 筛选出20对多态性高的EST-SSR引物用于52份老芒麦材料遗传多样性评价。PCR扩增反应在PTC-200热循环仪上进行, 扩增程序:94 ℃变性15 s, 65→ 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共5个循环; 接下来是94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1min, 共30个循环; 最后72 ℃延伸7 min; 4 ℃保存。扩增片段点样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶, 电泳后, 凝胶用AgNO₃溶液染色, 显影后在凝胶成像系统拍照。

对清晰度高、分辨度好的扩增条带按照条带的有无分别记为1, 0。参照以下公式^[24]计算每一对EST-SSR引物的多态信息含量值(PIC):

PIC=1-p²-q².

式中:p表示有带所占的频率, q表示无带所占的频率。条带的信息量(Ib)按照如下公式^[25]计算:

Ib=1-(2× |0.5-p|).

式中:p表示有带的品种或基因型所占的比例。

条带的分辨率(Rp)通过如下公式来计算^[24]:

Rp=∑ Ib.

POPGENE 32 v1.31软件^[26]用在假定Hardy-Weinberg平衡条件下计算这些材料的遗传一致度(GI)、遗传距离(GD)、多态性条带数(NPB)、多态性百分比(PPB)、香农多样性信息指数(I)、Nei’ s基因多样性(H)及观察等位基因数(Na)。采用AMOVA v1.55软件分析类群内和类群间遗传变异^[27]。STRUCTURE v2.3.4软件^{[28, 29]}进行遗传结构分析。由NTSYS v2.10软件进行主坐标分析, 同时利用品种和栽培材料的数据, 结合Winboot软件构建系统树图^{[30, 31]}。其中, POPGENE和AMOVA的输入文件由DCFA v1.1软件准备^[32]。

老芒麦DNA指纹图谱的构建主要参考鸭茅指纹图谱构建的方法^[33]。DNA指纹模型通过数字0和1转换为计算机语言来表示, 即1代表有带, 0代表无带^[34]。

本研究中, 20对EST-SSR引物是由100对EST-SSR引物筛选而来, 这些引物可扩增出多态性高且清晰的条带(表2)。每对引物扩增出的多态性条带数量从2(Ps3577)到21(Elw306)不等, 平均值为8.8。20对EST-SSR引物的多态信息含量(PIC)变化范围为0.26(Ps3577)~0.50(Ps1475, Elw228)。条带分辨率(Rp)从0.27(Ltc0055)到7.42(Elw404)不等, 平均值为3.01。基于以上结果, Elw306(总条带数和多态性条带数均为最大值)、Elw404(Rp为最大值)、Ps2283、Elw195和Elw187这5对引物在遗传多样性分析中具有更多的潜力, 可以较少的引物研究更多的个体和取样点。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 20对EST-SSR引物用于老芒麦品种、栽培材料和野生材料基因型的研究 Table 2 20 EST-SSR primers used to genotype Elymus sibiricus cultivars and, cultivated and wild accessions 引物编号 Primer ID 引物序列 Primer Sequence (5'-3') 总带数条 (TB) Total bands 多态性条 (PB)带/条 Polymorphic bands/band 多态性条带 百分比(PPB) Percentage of polymorphic bands/% 多态信息 含量(PIC) Polymorphic information content 条带分辨率 (RPP) Resolving power of primer Elw081 GGATAGACCCATGAGCTGACTGAT CTTTCTCCACAAGTTGAACACAACA 11 11 100.00 0.31 3.58 Elw087 TAGCAATAAGTTGCTGCTGCTGTT CCACCTCTAAATTAATCACCACGAA 8 8 100.00 0.49 1.73 Elw136 AAATGTCAACGACGAAAAAGGAAA ATGTAGCCTTGAGAACACTGGTCC 10 6 60.00 0.31 2.58 Elw187 AGCTCCTGATAGAAAGAGCCATCA GGCTGCTGGAACTGAAGACAGTA 11 11 100.00 0.45 5.58 Elw194 CAGCACTAGTATCCACCTCCACCT TGTTACAGCCTCTTCAGGCTCTTC 5 3 60.00 0.46 0.54 Elw195 TGTTGACAAAAGCAGTTGAAGGG GATTTGACCATGGACTGCTTCAC 12 11 91.67 0.42 4.35 Elw226 CTCTAGGGTTTTGGGATTTTAGCC GTTGTGGAGGTCGGAGAAGGT 7 6 85.71 0.48 3.46 Elw228 TTCAAACCACAAGAGGAGAAGGAC TGGTGGTGGTAGTATTGGTTGTTG 6 5 83.33 0.50 1.38 Elw306 TCCTCAAACTCCTCCTCTCTTCG GAGGTAAGTCTCGACATCCTCGAC 22 21 95.45 0.47 6.81 Elw404 AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG ATTTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC 20 20 100.00 0.31 7.42 Ps1475 CCCCAGTCTCCTCCATACATACAC GTCTTGCCCGGAAAATTTACCTAC 6 3 50.00 0.50 0.58 Ps1830 GACTCGGCGAAAGGACTCTCT CTCGACGTCCTTCATGAGCTT 13 11 84.62 0.48 3.04 Ps2117 TCCAAGACCTCGGTACTGGAAC CTGATGTAGGTACGGTCCTGCTCT 8 7 87.50 0.49 1.00 Ps2283 GCCACAACAAGAGAAGACCTTGC GACCTGCATGATGCTCTCGC 18 17 94.44 0.40 7.31 Ps261 CTCGAATCCAGCTGAACAATTTCT AGTCGATCCTCACCTTCATCTCC 8 7 87.50 0.44 2.77 Ps3447 AGCTTTATGAAGATCGCCACTCAC CTGCTGCTGCTACCGTTCTTATTT 12 10 83.33 0.44 2.35 Ps3577 CATCTTGCATATAGCTCCTTCGCT CTCAAGAAACCCACAATCCAATTC 4 2 50.00 0.26 1.23 Ps938 TTGCTCCTATGGTTCCACGTAGTT AAAGTGAAATTCTGCCATCAGAGC 10 8 80.00 0.47 2.08 Ltc0055 AAGAAGAAGAGGCCGAGGAATAAA CGTGGATGTGCTGCAGGTAGTA 6 3 50.00 0.44 0.27 Ltc0157 GCAATGAACACTGAATCAATCGAG CGTGTGAGACTCATCGATGTTACC 7 6 85.71 0.49 2.08 平均值 Mean 10.2 8.8 86.27 0.43 3.01 合计Total 204 176 - - -

表2 20对EST-SSR引物用于老芒麦品种、栽培材料和野生材料基因型的研究 Table 2 20 EST-SSR primers used to genotype Elymus sibiricus cultivars and, cultivated and wild accessions

引物Elw404和Elw195的条带分辨率及多态信息含量值较大, 被选作用于构建7份老芒麦品种和栽培材料的DNA指纹图谱(图1)。两对引物扩增的条带数分别为17和14, 条带大小范围为109~335 bp, 这些独一无二的指纹图谱很容易将7份供试材料相互区别开。

图1

Fig. 1

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	图1 通过Elw404和Elw195两对引物构建老芒麦品种(栽培种)指纹图谱 注:1号材料为同德, 2号材料为青牧1号, 3号材料为PI499468, 4号材料为川草2号, 5号材料为红原, 6号材料为PI499457, 7号材料为PI499456。Fig. 1 Molecular fingerprinting of Elymus sibiricus cultivars (cultivated accessions) using the primers Elw404 and Elw195 Note: 1, Tongde; 2, Qingmu No.1; 3, PI499468; 4, Chuancao No.2; 5, Hongyuan; 6, PI499457; 7, PI499456.

20对引物共扩增出204条带, 其中176条带(86.27%)为多态性条带(表1), 表明52份老芒麦材料具有高水平的遗传多态性。此外, 与品种和栽培材料(PPB=50.98%, I=0.234 7, H=0.151 0, Na=1.509 8)相比, 野生老芒麦材料具有更大的变异性(PPB=85.29%, I=0.296 6, H=0.179 8, Na=1.852 9)(表3), 这一结果可能与试验中栽培材料数量较少有关。同时表明野生老芒麦材料有着广泛的遗传背景, 可作为重要的基因库用于品种改良。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 EST-SSR标记用于老芒麦品种和栽培材料与野生材料的遗传变异性 Table 3 Genetic variability between cultivar & cultivated accessions and wild groups of Elymus sibiricus detected by EST-SSR markers 多样性指数 Genetic variability 品种与栽培材料 Cultivar & cultivated accessions 野生材料 Wild accessions 多态性条带数量PB/条 104 174 多态性条带百分比PPB/% 50.98 85.29 香农多样性信息指数I 0.234 7 0.296 6 Nei’ s遗传多样性指数H 0.151 0 0.179 8 等位基因观察值Na 1.509 8 1.852 9 注:１号材料为同德, ２号材料为青牧１号, ３号材料为PI４９９４６８, ４号材料为川草２号, ５号材料为红原, ６号材料为PI４９９４５７, ７号材料为PI４９９４５６ Note: PB, Polymorphic bands; I, Shannon information index of diversity; H, Nei’ s genetic diversity; Na, observed number of alleles values.

表3 EST-SSR标记用于老芒麦品种和栽培材料与野生材料的遗传变异性 Table 3 Genetic variability between cultivar & cultivated accessions and wild groups of Elymus sibiricus detected by EST-SSR markers

AMOVA分析表明, 老芒麦地理类群内部的遗传变异为73.94%, 地理类群间的遗传变异为26.06%(表4)。5个地区材料的遗传一致度(GI)从0.941 0到0.895 2不等(表5)。青海和新疆材料间的遗传一致度最小, 为0.895 2。四川与甘肃材料间的遗传一致度最大, 为0.941 0, 两个类群材料均采样于青藏高原的东北缘。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 基于EST-SSR标记对老芒麦的分子方差分析 Table 4 Analysis of molecular variance of Elymus sibiricus based on EST-SSR markers 类项 Item 地理类群间 Among geographic regions 地理类群内 Within geographic regions 自由度df 4 47 平方和Sum of squares 337.18 831.03 方差组分Variance component 6.37 18.07 总变异Total variation/% 26.06 73.94

表4 基于EST-SSR标记对老芒麦的分子方差分析 Table 4 Analysis of molecular variance of Elymus sibiricus based on EST-SSR markers

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 老芒麦5个地理类群间Nei’ s遗传一致度(对角线上部)和遗传距离(对角线下部) Table 5 Pairwise Nei’ s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) for five geographical populations of Elymus sibiricus 地理区域 Geographical populations 青海 Qinghai 新疆 Xinjiang 四川 Sichuan 内蒙古 Inner Mongolia 甘肃 Gansu 青海Qinghai - 0.895 2 0.904 0 0.904 0 0.906 5 新疆Xinjiang 0.110 7 - 0.931 3 0.916 2 0.912 2 四川Sichuan 0.101 0 0.071 2 - 0.922 9 0.941 0 内蒙古Inner Mongolia 0.100 9 0.087 5 0.080 2 - 0.923 9 甘肃Gansu 0.098 2 0.091 9 0.060 8 0.079 1 -

表5 老芒麦5个地理类群间Nei’ s遗传一致度(对角线上部)和遗传距离(对角线下部) Table 5 Pairwise Nei’ s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) for five geographical populations of Elymus sibiricus

借助STRUCRURE V 2.3.4软件, 基于哈迪温伯格(Hardy-Weinberg)平衡, 对52份材料的遗传结构进行评估, 根据最大似然值和Δ K值可得到类群数目的最佳值(图2)。K=5时, 所有的材料聚集为5个类群, 这与老芒麦地理分布几乎一致, 因此5就是最合适的类群数目。类群Ⅰ 包括来自青海省的2个品种和3份野生材料; 类群Ⅱ 包含来自新疆的1个栽培材料和9份野生材料; 类群Ⅲ 包括来自四川省的2个品种和7份野生材料; 类群Ⅳ 包含来自内蒙古的2个栽培材料和4份野生材料; 最后一个类群包括来自甘肃省的22份野生材料。主坐标分析遗传关系的结果与结构分析一致:前3个主成分可解释69.44%的总变异, 它们分别占39.61%、29.83%和13.77%(图3)。

图2

Fig. 2

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	图2 中国52份老芒麦材料遗传结构分析 注:类群编码同表1所示, 不同的个体具有相同的颜色表示它们归属为同一类群。Fig. 2 STRUCTURE analysis of 52 Elymus sibiricus accessions in China Note: The population codes are indicated in Table 1. Same color in different individuals indicates that they belong to the same cluster.

图3

Fig. 3

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	图3 基于EST-SSR标记使用Dice遗传相似矩阵对52份老芒麦进行主坐标分析的三维发散图Fig. 3 Principal coordinates analysis of three-dimensional scatter diagram for EST-SSR markers using the Dice genetic similarity matrix for 52 Elymus sibiricus accessions

利用统计所得数据, 将3个品种和4份栽培材料单独进行聚类, 由此得到的系统树图揭示了这几份材料间的遗传关系(图4)。这些材料聚为两大类(Ⅰ 和Ⅱ ), 并且类群Ⅰ 包括3个亚类群(A, B, C)。3个省(区)的6份材料聚在类群Ⅰ , 同一地区的2份材料又形成单独的亚类群, 而类群Ⅱ 仅包括来自新疆的1个栽培材料。

图4

Fig. 4

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	图4 基于Jaccard’ s遗传相似性及非加权组平均法推导出老芒麦品种和栽培材料的系统树图 注:图中只表示出bootstrap值大于50%的部分。Fig. 4 UPGMA-derived dendrogram of Elymus sibiricus cultivar and cultivated accessions based on Jaccard’ s genetic similarity Note: Only bootstrap values higher than 50% are presented.

老芒麦种质遗传多样性的研究, 既可促进对该物种种质资源的管理、评价及利用, 也是创制老芒麦优异新品种的基础工作^[35]。本研究中, 利用EST-ISSR引物扩增的多态性条带百分比(PPB)为86.27%, 表明老芒麦具有高水平的遗传多样性。该结果与前人的研究结果相似, 如SRAP(PPB=86.48%)^[4], SSR(PPB=86.88%)^[5], 高于ISSR(PPB=77.20%)^[3]和RAPD(PPB=78.65%)^[2], 但是低于SCoT(PPB=89.0%)^[6]和醇溶蛋白(PPB=90.4%)^[19]。老芒麦高水平的遗传多样性可能是由于其地理来源多样化和分子标记的高效性, 在象草(Pennisetum purpureum)^[36]和大豆(Glycine max)^[37]的研究报道中已证明地理来源和遗传多样性之间有较强的相关性, 严学兵等^[38]认为地理生态环境与披碱草属植物的遗传变异有关, 并指出青藏高原与蒙古高原多变的气候与环境因素会引起该属同种不同居群间遗传变异增大。本研究中, 用于研究的52份老芒麦来自5个不同的地理区域, 且它们具有不同的生态地理条件。有研究认为, 引物平均多态信息含量值(PIC)与群体遗传变异程度正相关^[39]。本研究所用20对EST-SSR引物PIC值范围为0.260.50, 平均值为0.43, 表明供试老芒麦材料间遗传变异程度较高。同时, 这些引物扩增出204条带, 其中176条具多态性。以上结果及前人的研究分析均表明EST-SSR标记用于评价老芒麦遗传多样性是一种有效的工具。

关于野生材料与品种/栽培材料间遗传多样性比较的研究未见报道。本研究结果表明, 与品种/栽培材料(PPB=50.98%, I=0.234 7, H=0.151 0, Na=1.509 8)相比, 野生材料(PPB=85.29%, I=0.296 6, H=0.179 8, Na=1.852 9)具有更高的遗传多样性。有研究表明, 与野生材料相比, 品种/栽培材料的遗传多样性较低, 如荔枝(Litchi chinensis)^[40]、水稻(Oryza rufipogon)^[41]、大豆^[42]和珍珠粟(Pennisetum glaucum)^[43]等。研究者曾指出与目的农艺性状相关的大多数位点(如生育期、叶面积和产量等)在育种进程中被选择并保留下来, 但也有很多基因在此过程中丢失^[44]。

单株选择法或系谱法, 是自花授粉植物培育新品种的一种基本方法^[45]。前人报道指出, 单株选择法可以从混合系中分离出纯系, 并可以在其子代保留最好的基因型^[46]。因此, 作为一种自花授粉植物, 老芒麦在育种进程中可能因多次单株选择, 导致杂合子的数目减少而纯合子增加^[47]。以上因素降低了老芒麦品种/栽培材料的遗传多样性。相比之下, 野生种质材料, 因此它们具有更高的遗传多样性^{[48, 49]}。因此, 具有丰富遗传多样性的野生材料在今后的育种工作中应作为重要的遗传资源。

本研究采用EST-SSR标记构建老芒麦指纹图谱, 能够区别不同品种及栽培材料的遗传特异性, 同时也为国内老芒麦品种知识产权和育种家的权益提供保障。

其他的研究已证明国内的老芒麦种质资源丰富且具多样性, 可以通过不同的标记方法揭示其丰富的表型性状和较高的遗传多样性^{[2, 3, 4, 5, 6, 18, 19]}。本研究发现, 与品种/栽培材料比较, 野生材料具有更高的遗传多样性, 且地理类群内具有更大的遗传变异。研究表明, 近年来生态环境日益恶化加之自然灾害频发, 造成大量野生老芒麦种质资源急剧下降^[50]。同时, 落后、单一的育种方法及种质收集保存不充分, 使得国内只有少数的老芒麦品种^{[51, 52]}。因此, 需要更加关注原位保护和非原位保护, 以及特殊地理类群的老芒麦种质的收集与保护, 从而为优异种质筛选和育种奠定基础。

综上, EST-SSR分子标记是研究老芒麦种质遗传多样性的有效方法, 由此也证明我国老芒麦种质具有丰富的遗传变异, 这在野生老芒麦材料中体现的尤为明显。为此, 在开展老芒麦育种研究工作的同时, 也更应注重老芒麦种质资源的收集、保护和利用等。