试验地位于深圳市仙湖植物园科普实验园, 前期采用农杆菌浸种遗传转化法获得35株转胡杨PeDREB2b基因的白三叶, 后对其匍匐茎进行跟踪分子检测, 筛选出7个转基因白三叶新材料, 通过无性扩繁形成新株系(分别命名为W1-2、W1-3、W4-2、W13-4、W17-1、W28-2、W33-3), 以非转基因白三叶海发为对照。采其茎段进行扦插繁殖, 成活后移入盆中, 常规养护管理半年得到试验用苗, 植株生长健壮、长势一致。模拟试验采用长41 cm, 宽26 cm, 高19 cm的塑料盆作为水培器材, 将塑料泡沫板打孔后置于盆表面, 将试验苗插于盆内的营养液中, 营养液选用Hoagland营养液配方。

1.2.1 转基因白三叶表型特征的观测 试验前记录白三叶海发品种及其转基因株系植株的叶形、叶色等数据, 然后每株系取从匍匐茎顶端起2~3片成熟叶, 共10片于扫描仪下进行扫描, 通过Photoshop进行叶长、叶宽及叶面积的测定。

1.2.2 转基因白三叶抗旱性研究 选取长势基本一致的白三叶海发品种及其转基因株系苗, 洗净根部后分别插入泡沫板的孔中, 用海绵固定, 置于盛有1/2Hoagland营养液的塑料盆上, 在营养液中缓苗2 d。配制不同胁迫浓度的聚乙二醇(PEG6000)溶液, 浓度分别为50 g· L^-1 PEG(T₁, 轻度胁迫)、100 g· L^-1 PEG(T₂, 中度胁迫)、150 g· L^-1 PEG(T₃, 重度胁迫), 对应渗透势分别为-0.5、-1.5、-3.0 MPa。渗透势计算公式如下^{[11, 12]}:

ψ S=-(1.18× 10^-2)C-(1.18× 10^-4)C²+(2.67× 10^-4)CT+(8.39× 10^-7)C²T.

式中, ψ S为渗透势, C为PEG-6000浓度(g· L^-1), T为温度(25 ℃)。

试验各处理均在培养箱内进行, 温度为25 ℃, 相对湿度为75%~85%, 光照周期为12 h/12 h(光照/黑暗)。每胁迫处理选取5株幼苗为重复。以不加PEG6000的幼苗作为对照, 于胁迫开始前0 h(CK), 胁迫24 h(D₁)、胁迫48 h(D₂)取样。选择从匍匐茎顶端起2~3片生长良好、大小均一的成熟叶片, 每个指标取5株幼苗混合采样, 重复3次, 进行各项生理指标的测定。

植株永久萎蔫率采用称重法测定^[13]。试验前, 将所有参试植株, 同一时间浇透水后, 断水观察, 发现参试植株叶片萎蔫下垂、翌日清晨不能恢复正常, 即取盆中土壤测定土壤含水量, 即为植物的永久萎蔫率。叶片相对含水量按照饱和含水量法测定^[14]。叶片相对电导率采用电导法。MDA含量采用TBA法测定^[15]。

采用Excel进行原始数据整理; 采用SAS 9.0软件进行显著性分析; 使用隶属函数法对其耐旱性进行综合评价。

部分转基因白三叶株系的叶形、叶色、叶片斑纹及叶片大小等表型特征发生了明显变异(表1)。如株系W13-4叶片形态表现为圆形、深绿色(图1-Ⅳ ); W1-2(图1-Ⅱ )、W1-3为椭圆形、浅绿色; 而W17-1、W28-2、W33-3则仍表现为倒卵形、绿色与未转基因的白三叶无差异; W4-2叶片斑纹缺失, 显示为纯绿色(图1-Ⅲ )。从叶片大小来看, 转基因株系W17-1和W28-2的叶长、叶宽及叶面积均显著变小(P< 0.05), 而W4-2叶片大小较对照显著增大。节间长度除W13-4显著变长外, 其它株系同对照无显著差异(P> 0.05)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 参试白三叶株系表型特征 Table 1 Phenotypic features of test material Trifolium repens 株系 Line 叶形 Leaf shape 叶色 Leaf color 叶长 Leaf length/cm 叶宽 Leaf width/cm 叶面积 Leaf area/cm2 节间长度 Internode length/cm 海发Haifa 倒卵形Obovate 绿Green 2.24± 0.13b 1.89± 0.15abc 3.32± 0.32b 1.73± 0.12bc W1-2 椭圆形Ellipse 浅绿Light green 2.38± 0.26ab 1.74± 0.23c 3.20± 0.68b 1.77± 0.11bc W1-3 椭圆形Ellipse 浅绿Light green 2.38± 0.19ab 1.80± 0.18bc 3.20± 0.51b 1.89± 0.09bc W4-2 椭圆形Ellipse 绿Green 2.47± 0.15a 2.03± 0.18a 3.87± 0.50a 1.99± 0.13abc W13-4 圆形Round 深绿Deep green 2.08± 0.07c 1.81± 0.10bc 2.86± 0.20b 2.42± 0.21a W17-1 倒卵形Obovate 绿Green 1.79± 0.24d 1.54± 0.13d 2.32± 0.40c 2.13± 0.19ab W28-2 倒卵形Obovate 绿Green 1.78± 0.15d 1.44± 0.18d 1.95± 0.32c 1.62± 0.10c W33-3 倒卵形Obovate 绿Green 2.28± 0.20b 1.96± 0.20ab 3.32± 0.63b 1.94± 0.18bc Note:Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different lines at 0.05 level. W1-2, W1-3, W4-2, W13-4 , W17-1, W28-2, W33-3 are all transgenic line. The same below. 注:同列不同小写字母表示不同株系间差异显著(P< 0.05)。W1-2、W1-3、W4-2、W13-4、W17-1、W28-2、W33-3为转基因株系。下同。

表1 参试白三叶株系表型特征 Table 1 Phenotypic features of test material Trifolium repens

图1

Fig. 1

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	图1 部分参试白三叶株型形态Fig. 1 Type of some test material Trifolium repens

7个白三叶转基因株系的永久萎蔫率均低于对照, 表现出一定的抗旱性(表2)。其中W1-3、W28-2永久萎蔫率较对照降低较多, 分别降低了36.1%和26.27%, 结合断水天数来看, 这两个株系均能维持较长时间的正常生长, 具有较强的抗旱性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 参试白三叶株系永久萎蔫率 Table 2 The permanent wilting rate of test material Trifolium repens 株系 Line 永久萎蔫率 Permanent wilting rate/% 断水天数 Days without water/d 海发Haifa 11.42 9 W1-2 9.35 9 W1-3 7.29 12 W4-2 9.14 11 W13-4 9.07 10 W17-1 9.79 11 W28-2 8.42 11 W33-3 9.19 9

表2 参试白三叶株系永久萎蔫率 Table 2 The permanent wilting rate of test material Trifolium repens

图2

Fig.2

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	图2 模拟干旱胁迫对参试白三叶叶片相对含水量的影响 注:不同小写字母表示不同渗透势不同胁迫时间间差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.2 The effect of simulated drought stress on relative water content of test material Trifolium repens Note: Different lower case letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

模拟干旱胁迫对7个白三叶转基因株系及对照海发植株叶片的相对含水量产生了较大的影响, 随着胁迫时间的延长及胁迫程度的加大, 其叶片相对含水量总体呈下降趋势(图2)。在胁迫24 h后, 白三叶株系W1-3随胁迫程度的增加呈小幅增高再降低的趋势, 梯度间变化差异不显著(P> 0.05)。其它株系和对照则随胁迫程度的增加叶片相对含水量下降, 其中株系W4-2和W13-4在最高胁迫浓度下, 降幅均在40%以上, 变化显著(P< 0.05)。在模拟干旱胁迫48 h后, 除株系W1-3、W33-3随着胁迫浓度的增加降低趋势不显著外, 其它白三叶株系及对照的叶片相对含水量均大幅度降低。在T₃的胁迫浓度下, 对照白三叶海发、株系W13-4的叶片相对含水量降幅均在50%以上; 而株系W1-3、W28-2、W1-2、W33-3等4个株系叶片相对含水量降幅较低, 分别为20.3%、23.6%、25.5%、26.6%。从白三叶海发及7个转基因株系的叶片相对含水量的变化上来看, 在胁迫24和48 h时, 株系W1-3、W28-2的叶片相对含水量始终保持较高水平且高于试验组其它株系, 在变化趋势上也未随着胁迫的加剧有较大波动, 体现出其叶片有较强的保水能力, 植株的抗旱能力较强。

图3

Fig.3

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	图3 模拟干旱胁迫对参试白三叶叶片相对电导率的影响Fig.3 The effect of simulated drought stress on relative electric conductivity of test material Trifolium repens

白三叶海发及7个转基因株系的叶片相对电导率随胁迫浓度加剧及胁迫时间延长均有不同程度的升高(图3), 但动态变化及增加幅度明显不同。在胁迫24 h后, 白三叶株系W17-1及W1-3随胁迫浓度的增加呈降低再升高的趋势, 其中, W1-3在不同浓度下电导率变化不显著(P> 0.05)。其它株系则随胁迫浓度的增加叶片相对电导率呈明显升高趋势, 其中对照海发和转基因株系W4-2在最高胁迫浓度下, 电导率增幅是其对照的两倍以上。在模拟干旱胁迫48 h后, 除白三叶海发、株系W17-1叶片相对电导率随胁迫浓度的增加呈降低再升高的趋势外, 其它株系均大幅度升高。在T₃的胁迫浓度下, 对照白三叶海发增幅是对照的4.85倍; 而株系W1-3叶片相对电导率增幅则较低, 仅为对照的0.53倍。从叶片相对电导率的变化趋势来看, 在胁迫24和48 h时, 株系W1-3、W1-2、W13-4的叶片相对电导率随着胁迫浓度的加剧变化幅度相对较小, 说明了其叶片细胞膜受到的破坏程度较低, 具有较强的抗旱能力。

图4

Fig.4

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	图4 模拟干旱胁迫对参试白三叶叶片丙二醛含量的影响Fig.4 The effect of simulated drought stress on malondialdehyde content of test material Trifolium repens

植物器官在逆境条件下, 往往发生膜脂过氧化作用, 丙二醛(MDA)是其产物之一, 通常作为干旱伤害的指标^{[16, 17, 18]}。白三叶海发及7个转基因株系的叶片丙二醛含量随胁迫浓度加剧及胁迫时间的延长总体有不同程度的升高(图4)。模拟干旱胁迫24 h后, 白三叶株系W4-2、W33-3随胁迫浓度的增加其叶片丙二醛含量呈先增加后小幅降低的趋势; 株系W28-2则随胁迫浓度的增加先小幅降低后升高; 海发及其它株系植株叶片丙二醛含量随胁迫浓度增加而持续升高。干旱胁迫48 h后, 除株系W4-2、W33-3随胁迫浓度的增加呈先增加后小幅降低的趋势外, 其它株系植株随胁迫浓度的增加显著升高(P< 0.05)。在本研究中, 从植株叶片MDA含量的变化积累来看, 株系W1-3在试验中其MDA含量始终保持较低水平, 且随胁迫的加剧变化较小, 说明其叶片受伤害的程度较小, 植株耐旱性较强。

植物抗旱性是受多种因素影响的复杂综合性状, 这些因素的综合作用才促进了抗旱性的形成^[19]。因此, 对于植物抗旱性的评价应用尽可能多的指标来综合评价, 从而弥补单个指标对于评定植物抗旱性所造成的片面性, 使评定结果与实际结果更为接近^{[20, 21]}。本研究通过测定白三叶海发及其7个转基因株系的相对含水量、相对电导率、MDA含量3个生理指标在不同浓度的模拟干旱胁迫下, 胁迫24和48 h的变化值, 并利用隶属函数法, 对参试植物的各个指标隶属值进行累加, 求取平均值, 平均数越大, 抗旱性就越强, 结果表明(表3), 白三叶海发及7个转基因株系抗旱性大小排序为:W1-3> W33-3> W28-2> W1-2> W13-4> W17-1> W4-2> 海发。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 参试白三叶抗旱能力综合评价结果 Table 3 Comprehensive appraisal of drought resistance of test material Trifolium repens 株系 Line 相对含水量 Relative water content 相对电导率 Relative electric conductivity 丙二醛含量 Malondialdehyde content 各指标隶属度均值 Average of membership degree 位次 Rank 海发Haifa 0.00 0.00 0.00 0.00 8 W1-2 0.73 0.62 0.49 0.61 4 W1-3 1.00 1.00 1.00 1.00 1 W4-2 0.18 0.00 0.51 0.23 7 W13-4 0.17 0.46 0.66 0.43 5 W17-1 0.24 0.25 0.34 0.28 6 W28-2 0.83 0.93 0.33 0.70 3 W33-3 0.78 0.78 0.68 0.75 2

表3 参试白三叶抗旱能力综合评价结果 Table 3 Comprehensive appraisal of drought resistance of test material Trifolium repens