木霉菌(Trichoderma spp.)作为自然界广泛存在的真菌之一，不仅对植物真菌及植物线虫病害具有防治作用^[1]，而且具有促进植物生长、提高植物抗性和耐盐等功能，如谢琳淼等^[2]发现哈茨木霉(Trichoderma harzianum)能够促进紫羊茅(Festuca rubra)和草地早熟禾(Poa pratensis)生长，并诱导其产生抗病性；陈臻等^[3]研究表明长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液能促进禾本科和豆科牧草及白三叶(Trifolium repens)种子及幼苗的生长，提高植物抗病性；古丽君等^[4]发现深绿木霉(Trichoderma aureoviride)对草坪禾草腐霉病原菌瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)生长具有抑制作用；张树武等^[5]发现长枝木霉T6菌株孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)二龄幼虫具有寄生和致死作用，但是有关木霉菌对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)致死作用方面研究较少。

据报道，几丁质层和蛋白层作为线虫卵壳和体壁的主要组成成分，对线虫起保护作用，阻止外来物的侵入^[6]，目前已从多种生防菌中发现其胞外蛋白酶对线虫具有毒杀作用，如食线虫真菌的丝氨酸蛋白酶作为一种重要的毒力因子在降解线虫体壁的过程中发挥着重要作用^[7]；长枝木霉产生的胞外几丁质酶与线虫卵寄生率正相关^[8]；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中高溶解度pachi融合蛋白与Cry21Aa混合，可快速降解秀丽隐杆线虫卵壳、角质层和肠道，能有效防治线虫^[9]。同时，木霉菌分泌的几丁质酶和蛋白酶能降解线虫的卵壳和体壁，使线虫发育受阻、卵壳溶解、内容物外渗^[10-11]，但是目前有关长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对线虫行为毒性和繁殖能力影响方面尚少见研究。

前期研究发现长枝木霉PT6蛋白培养滤液对禾谷孢囊线虫具有较好的毒杀活性^[12]，但是其蛋白粗提液对线虫行为毒性和繁殖能力是否有影响方面。秀丽隐杆线虫作为一种模式线虫，具有生活周期短、易培养、结构简单、通体透明易观察和对毒性敏感等特点^[13]。因此，以模式线虫秀丽隐杆线虫作为供试线虫，探究T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫头部摆动频率、身体弯曲频率、基本运动能力、觅食能力和繁殖能力的影响，以期为T6菌株蛋白粗提液防治植物寄生线虫提供理论依据。

1.   材料和方法

1.1   供试材料

长枝木霉T6菌株：由甘肃农业大学植物保护学院植物病原实验室分离保存。

秀丽隐杆线虫野生型N2线虫：购自福建上源生物科学技术有限公司，并保存于甘肃农业大学植物保护学院植物病毒学和分子生物学实验室。

K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液：10.83 g K₂HPO₄、3.56 g KH₂PO₄，加适量水溶解并定容至100 mL，调节pH 6.0，高温高压灭菌备用。

OP50：大肠杆菌。

NGM培养基：NaCl 3 g、蛋白胨2.5 g、琼脂粉18 g，加水定容至1 L，高压灭菌后分别加入灭菌的1 mol·L⁻¹的MgSO₄溶液、CaCl₂溶液、K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液1 mL，立即混匀。

酪蛋白培养基：10 g酪蛋白加入1 L水中溶解。

M9缓冲液：1.5 g KH₂PO₄、3 g NaHPO₄、1.5 g NaCl、0.5 mL 1M MgSO₄溶液，加水至500 mL，高压灭菌后分装使用。

线虫裂解液：将5 mol·L⁻¹的NaClO溶液、5 mol·L⁻¹的NaOH溶液及超纯水以1 ꞉ 1 ꞉ 1的比例混合，现配现用。

1.2   试验方法

1.2.1   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液的制备及浓度的测定

参考张树武等^[5]方法制备发酵液。取1皿培养4 d的长枝木霉T6菌株PDA培养基加入无菌水，将孢子悬浮液浓度配制为每毫升1.0 × 10⁷个，并在每50 mL酪蛋白培养基中加入1 mL分生孢子悬浮液，置于28 ℃、180 r·min⁻¹恒温摇床培养4 d后离心过滤(4 ℃，12000 r·min⁻¹) 25 min，收集上清液即为无菌发酵液原液。然后，将得到的无菌发酵液进行硫酸铵盐析沉淀至饱和，于4 ℃静置12 h后并经离心收集沉淀，利用20 mol·L⁻¹ Tris-HCl溶解后透析除盐获得蛋白粗提液。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度^[14]。取125 μL考马斯亮蓝染色液加入25 μL待测样品中反应，并置于595 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算蛋白质浓度，试验重复3次，得到蛋白粗提液的浓度为262.31 μg·mL⁻¹，后续分别稀释为50、100、150、200和250 μg·mL⁻¹备用。

1.2.2   秀丽隐杆线虫的培养及同步化处理

秀丽隐杆线虫的培养采用含大肠杆菌OP50的NGM培养基进行培养^[15]。利用M9缓冲液冲洗培养至产卵期的线虫并收集于离心管中，3500 r·min⁻¹离心1 min后弃上清，重复3次后按1 ꞉ 1的比例加入线虫裂解液，处理5 min后于3500 r·min⁻¹离心1 min，弃上清，重复3次后收集线虫沉淀，并加入1 mL M9缓冲液冲洗沉淀3次，即得到线虫卵。然后将其转入含有大肠杆菌OP50的NGM培养基中，于20 ℃下分别黑暗培养12、36和48 h后获得L1、L3和L4期的幼虫，并利用无菌K液冲洗3次后用于后续试验。

1.2.3   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫致死作用及显微观察

利用无菌的96孔细胞培养板测定蛋白粗提液的杀线活性，每孔中先加入10 µL浓度为1 mL 2 × 10²条秀丽隐杆线虫的L2期幼虫悬浮液，再分别加入90 μL蛋白粗提液，以加入等量的无菌水和20 mmol Tris-HCl (pH 7.5)分别作为阴性对照、阳性对照，每个处理16个重复，置于20 ℃恒温培养箱中黑暗培养，每隔6 h观察一次，死亡2龄幼虫虫体僵直且用竹针轻轻拨动时静止不动，活虫虫体呈弯曲状态且能蠕动。根据记录数据计算其校正死亡率。

死亡率= (死亡2龄幼虫数量/供试2龄幼虫数量) × 100%。

校正死亡率= (处理死亡率 − 对照死亡率)/(1 − 对照死亡率) × 100%。

利用无菌的24孔细胞培养板观察长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫的毒杀作用。试验中每个孔中先加入100 µL的L1期线虫悬浮液(每毫升100条)，再加900 µL不同浓度(50、150、和250 μg·mL⁻¹)的长枝木霉T6蛋白粗提液，以加入等量的无菌水作为对照，每个处理和对照均重复6次，置于20 ℃恒温培养箱中黑暗培养，分别在处理24、48和72 h时在显微镜下观察并拍照记录。

1.2.4   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫运动能力的测定

取无菌的96孔细胞培养板，将经过同步化处理且培养至L4期的秀丽隐杆线虫300条加入到900 μL稀释成不同浓度(分别为50、100、150、200和250 μg·mL⁻¹)的蛋白粗提液和含有大肠杆菌OP50的孔中，以加入等量无菌水作为对照，处理组和对照组均重复6次，置于20 ℃恒温培养箱中黑暗培养24 h后用K液冲洗3次并收集线虫于离心管中制成线虫悬浮液，用于各项生理指标的测定。

头部摆动频率参照许云等^[16]测定方法略作修改。将处理后的线虫用K液冲洗后，吸取20 μL的L4幼虫悬浮液于不含大肠杆菌OP50的NGM培养基上，使其恢复1 min后，在显微镜下观察并记录线虫在1 min之内的头部摆动频率，线虫头部从身体一侧摆到另一侧再摆回来记为摆动1次，每个处理观察20条线虫，重复3次。

身体弯曲频率参考Tsalik等^[17]的方法略作修改。将处理后的L4幼虫20 μL转移至不含大肠杆菌OP50的NGM培养基上，待1 min自由活动使其行为稳定，在显微镜下观察并记录线虫在20 s内的身体弯曲频率，假定线虫身体以咽泵方向为Y轴，其身体在X轴方向上的运动改变记为身体弯曲1次，每个处理观察20条线虫，重复3次。

1.2.5   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫基本运动能力测定

根据Murakami等^[18]方法测定线虫的基本运动能力，包括向前摆动、向后摆动、Omega/U型摆动。将20 μL利用不同浓度蛋白粗提液处理后的L4幼虫转移至不含大肠杆菌OP50的NGM培养基上，使其稳定1 min后于显微镜下观察记录线虫在30 s内的摆动次数，每个处理观察20条线虫，重复3次。

1.2.6   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫觅食能力测定

参考Kohra等^[19]方法略作修改。取食行为的测定采用菌落接触率法，用移液枪加5 μL的大肠杆菌OP50于直径为9 cm的NGM培养基中央，使其形成直径为1 cm的圆形菌斑，将不同浓度处理过的L4期线虫用K液冲洗3次后分别挑取10条于距培养基中心3 cm处，每个处理和对照重复3次，分别于2、4、6、8和24 h观察并记录接触到菌落的线虫数，计算菌落接触率。

1.2.7   长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线

参考Swain 等^[20]方法略作修改。将经过同步化处理培养至L3期的20条幼虫挑取至含有不同浓度蛋白粗提液和大肠杆菌OP50的NGM培养基上，以加入等量无菌水和大肠杆菌OP50为对照，培养12 h后取1条线虫转移至新的只含大肠杆菌OP50的NGM培养基上，置于20 ℃恒温培养箱观察其产卵情况，至秀丽隐杆线虫不再产卵，每个处理和对照重复10次。秀丽隐杆线虫的产卵量为每条线虫在产卵期产卵的总和。

1.2.8   数据处理

采用SPSS 27.0软件进行统计分析，用平均值 ± 标准误表示测定结果，分别对不同浓度同一处理时间和不同浓度不同处理时间进行单因素方差分析，并利用显著性分析和Duncan氏新复极差法进行多重比较。采用Excel 2016软件进行统计和作图。

2.   结果和分析

2.1   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫致死作用测定及毒杀作用显微观察

不同浓度长枝木霉T6菌株蛋白粗提液处理秀丽隐杆线虫6 h后，各浓度间其致死作用差异不显著(P > 0.05)，处理12 h后，只有250 μg·mL⁻¹蛋白粗提液处理后线虫致死作用与其他浓度差异显著(P < 0.05)；处理18和24 h后，随着浓度的增大和时间的延长，各浓度处理下线虫致死率出现明显差异(图1)。浓度为250 μg·mL⁻¹的蛋白粗提液处理秀丽隐杆线虫24 h对其毒杀作用最佳，线虫死亡率达75.42%，处理浓度和时间越短，毒杀作用越弱，浓度为50 μg·mL⁻¹的蛋白粗提液在处理线虫6 h时的死亡率仅为24.26% (图1)，因此后续采用50、150和250 μg·mL⁻¹进行显微观察。

图  1  不同浓度长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫的致死作用

N-CK为阴性对照，P-CK为阳性对照。不同小写字母表示相同时间不同浓度处理间差异显著(P < 0.05)；图6同。

Figure  1.  Lethality of different concentrations of Trichoderma longibrachiatum T6 crude protein extract against Caenorhabditis elegans

N-CK: negative control, P-CK: positive control. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment times for the same concentration at the 0.05 level. This is applicable for Figure 6 as well.

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图  2  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫致死作用显微观察

Figure  2.  Microscopic observations of the lethal effects of a crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 against Caenorhabditis elegans

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不同浓度长枝木霉T6蛋白粗提液处理秀丽隐杆线虫L1幼虫后，随着蛋白粗提取液浓度的增大及处理时间的延长，其毒杀作用呈逐渐增强的趋势。经50、150和250 μg·mL⁻¹的蛋白粗提液处理线虫24 h后，50 μg·mL⁻¹浓度处理的线虫可移动、弯曲(图2)，与对照相比无显著变化(P > 0.05)，而150和250 μg·mL⁻¹浓度处理的线虫虫体僵直、呈死亡状态；处理48 h后，50 μg·mL⁻¹浓度处理的线虫运动缓慢、虫体变直但未死亡，而 250和150 μg·mL⁻¹浓度处理的线虫体壁透明、虫体发生畸形；处理72 h后， 50 μg·mL⁻¹浓度下的线虫虫体僵直， 150 μg·mL⁻¹浓度下的线虫虫体明显透明、肠道断裂，250 μg·mL⁻¹浓度下的线虫虫体断裂、体壁溶解、内容物外渗，导致透明现象消失，然而对照处理的线虫72 h后仍然未发生死亡，只是运动速度缓慢、出现波形运动。

2.2   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫头部摆动频率的影响

经不同浓度长枝木霉T6菌株蛋白粗提液处理后，秀丽隐杆线虫头部摆动频率随着蛋白粗提液浓度的增大而逐渐降低。浓度为50和100 μg·mL⁻¹时，其头部摆动频率无显著差异(P > 0.05)；当浓度为150、200和250 μg·mL⁻¹时，各浓度间差异显著(P < 0.05)，其头部摆动频率与对照相比分别降低了53.39%、57.26%和76.00% (图3)。

图  3  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫头部摆动频率的影响

不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)；图4、图7同。

Figure  3.  Effects of a crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 on the frequency of head swinging in Caenorhabditis elegans

Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level. This is applicable for Figure 4, Figure 7 as well.

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2.3   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响

经不同浓度的长枝木霉T6菌株蛋白粗提液处理秀丽隐杆线虫24 h后，其身体弯曲频率随着蛋白粗提液浓度的升高而逐渐降低(图4)。浓度为50 μg·mL⁻¹时，线虫的身体弯曲频率与对照组相比差异不显著(P > 0.05)，而浓度为100、150、200、250 μg·mL⁻¹时，线虫的身体弯曲频率分别为1.25、1.16、0.72和0.29次·s⁻¹，与对照身体弯曲频率(27.9 次·s⁻¹)相比分别显著降低了90.14%、83.15%、51.61%和20.79% (P < 0.05)。

图  4  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响

Figure  4.  Effects of crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 on the frequency of body bending in Caenorhabditis elegans

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2.4   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫基本运动能力的影响

浓度为250、200和150 μg·mL⁻¹的长枝木霉T6菌株蛋白粗提液能够降低秀丽隐杆线虫向前和向后运动频率，浓度为100和50 μg·mL⁻¹的T6菌株蛋白粗提液对其无显著影响，而各浓度的T6菌株蛋白粗提液对Omega/U型摆动频率均无显著影响(P > 0.05)。与对照相比，向前运动频率与向后运动频率在蛋白粗提液浓度为250 μg·mL⁻¹时差异最明显，分别降低了48.21%和46.15% (P < 0.05)，当蛋白粗提液浓度小于200 μg·mL⁻¹时，向后运动频率与对照相比无显著影响，而向前运动频率随浓度的减小而增大(图5)。

图  5  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫基本运动能力的影响

不同小写字母表示相同运动方式不同处理间差异显著(P < 0.05)。

Figure  5.  Effects of a crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 on the mobility of Caenorhabditis elegans

Different lowercase letters indicate significant differences for the same among different treatments at the 0.05 level.

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2.5   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫觅食能力的影响

长枝木霉T6菌株高浓度蛋白粗提液短时间内对秀丽隐杆线虫菌落接触率存在抑制作用。浓度50 μg·mL⁻¹的T6菌株蛋白粗提液处理线虫2 h后其菌落接触率与对照相比无显著差异(P > 0.05)，其余浓度处理后差异显著(P < 0.05)，其中浓度为250 μg·mL⁻¹处理后其菌落接触率最低，与对照相比降低了63.78%；处理时间大于2 h后其菌落接触率无显著差异(P > 0.05)，处理24 h后其菌落接触率只在浓度为250 μg·mL⁻¹表现出差异，其余浓度下其菌落接触率无显著差异(图6)。

图  6  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫觅食能力的影响

Figure  6.  Effects of a crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the attainment level of Caenorhabditis elegans

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2.6   长枝木霉T6蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫繁殖能力的影响

与对照相比，当蛋白粗提液浓度较高时对秀丽隐杆线虫产卵量具有显著的降低作用(P < 0.05)，当蛋白粗提液浓度较低时对线虫产卵量无显著影响(P > 0.05)。当蛋白粗提液浓度小于150 μg·mL⁻¹时其产卵量与对照无显著差异，而浓度250和200 μg·mL⁻¹处理后产卵量降低作用显著，分别降低了30.47%和24.88% (图7)。

图  7  长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫产卵率的影响

Figure  7.  Effects of a crude protein extract from Trichoderma longibrachiatum T6 on the egg production of Caenorhabditis elegans

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3.   讨论

前期研究表明，线虫体壁是抵御外界不良环境的重要结构，主要由蛋白质、脂质和碳水化合物组成^[21]，真菌分泌的水解酶具有软化或破坏几丁质层而机械侵入的作用^[22]。本研究显微观察发现，不同浓度长枝木霉T6菌株蛋白粗提液对秀丽隐杆线虫具有致死作用且对体壁降解效果具有浓度依赖性，其中250 μg·mL⁻¹蛋白粗提液效果最明显，处理后可导致虫体断裂、体壁溶解、内容物外渗。Hu等^[23]发现内生细菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)蛋白酶粗提液对根结线虫体壁具有溶解作用，且能导致其内容物渗漏；这与黄薇^[24]发现侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)蛋白酶能够降解秀丽隐杆线虫体壁且线虫致死率与其浓度与呈正相关关系的研究结果一致。

另外，本研究发现，不同浓度的长枝木霉T6菌株蛋白粗提液处理线虫能显著抑制其头部摆动频率、身体弯曲频率、向前运动、向后运动能力，而对其Omega/U型摆动无显著影响，这与田雨等^[25]研究发现50 mg·L⁻¹久效磷处理秀丽隐杆线虫后其头部摆动频率、身体弯曲频率、向前运动和觅食能力显著降低，而Omega/U型摆动频率无显著差异的研究结果一致。运动行为是反应神经系统最基本的指标，受到外界刺激后线虫会躲避，并根据危险程度向前运动或改变方向^[26]。相关研究表明秀丽隐杆线虫运动受多种神经元调控，乙酰胆碱作为应用最广泛的神经递质，对线虫的多种运动起着重要的调控作用^[27]，推测T6菌株蛋白粗提液可能通过抑制神经递质的释放抑制了线虫的运动能力。本研究发现高浓度的长枝木霉T6菌株蛋白粗提取液降低了秀丽隐杆线虫的菌落接触率，影响了其觅食能力，而低浓度无显著影响。线虫的觅食行为是通过多种感应神经元寻找食物而产生的嗅器快速摆动^[28]，当外界胁迫使神经系统受损时，以菌落接触率为指标之一的觅食行为就会受到影响^[29]，推测T6菌株粗蛋白提取液通过扰乱神经系统进而抑制觅食行为。此外，高浓度T6菌株粗蛋白提取液能降低秀丽隐杆线虫的产卵量，而低浓度无显著影响，推测低浓度的蛋白粗提液暴露时间较短，中毒症状不明显，这与何龙喜等^[30]发现利用嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞外代谢产物处理松材线虫后产卵量降低的研究结果一致。

综上所述，长枝木霉T6蛋白粗提取液对秀丽隐杆线虫行为毒性和繁殖能力均具有显著的抑制作用，但有关长枝木霉T6蛋白粗提取液对秀丽隐杆线虫行为毒性和繁殖能力影响的关键蛋白种类和生物学功能有待进一步深入研究。

参考文献