红豆草OvIF7GT基因克隆与表达分析
异黄酮是豆科植物中一类典型的次级代谢产物，其化学结构多样性对于植物生长发育及抵御环境胁迫具有重要功能。本研究以高寒地区豆科牧草红豆草(Onobrychis viciifolia)为研究材料，根据转录组测序数据，从红豆草叶片中克隆获得一个异黄酮7-O-糖基转移酶(Isoflavone 7-O-glucosyltransferase，OvIF7GT)基因，并对该基因进行生物信息学、亚细胞定位和干旱胁迫下表达水平的分析。结果显示：1)本研究克隆得到的OvIF7GT大小为1 512 bp，编码503个氨基酸，蛋白质相对分子质量为56 774.36 Da；其编码蛋白是一种亲水性蛋白，具有两个跨膜结构域，62个磷酸化结合位点，理论等电点为5.51。2)保守结构域分析推测，OvIF7GT蛋白属于异黄酮糖基转移酶家族，主要由α-螺旋(41.75%)和无规则卷曲(35.79%)构成；系统发育进化关系分析表明该蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和鹰嘴豆(Cicer arietinum)中的IF7GT亲缘关系较近；此外，亚细胞定位分析显示OvIF7GT主要存在于细胞质中，在细胞核中也有分布。3)实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明，在干旱胁迫72 h后，红豆草幼苗中OvIF7GT显著受到干旱胁迫的诱导表达，且在叶中比根中的表达量更高。该研究结果表明，OvIF7GT参与了红豆草干旱胁迫的响应，可能在红豆草的抗旱中具有潜在功能。
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作为一类植物广泛产生的次级代谢产物，类黄酮不仅具有重要的药用价值，而且在植物生长发育及环境胁迫抗逆调控中具有重要作用[1-3]。在非生物胁迫如干旱胁迫下，植物体内往往会产生过多的活性氧，而类黄酮物质中存在多酚羟基的结构，具有清除氧自由基的活性，可以帮助植物降低活性氧水平，以此减轻植物受到的氧化损伤[4]。糖基化主要是在尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)的催化作用下，将供体糖上的糖基转移到小分子化合物上，而糖基化位置、糖基数目、糖苷键性质的差异，导致类黄酮化学和功能更具多样性[5]。最新研究也表明，类黄酮的糖基化过程参与了植物对环境胁迫的应答[6]，如以类黄酮为糖基化底物的糖基转移酶基因UFGT2在玉米(Zea mays)中过表达，促进了类黄酮苷的积累，进而增强了玉米对干旱和盐环境的抗性[7]。此外，豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)糖基转移酶UGT71G1对异黄酮和黄酮醇槲皮素具有较高的糖基化效率，提高了蒺藜苜蓿对非生物胁迫的抗性[8-9]。由此看出，类黄酮及参与其生物合成的基因如UGT在应答和抵御植物环境胁迫中发挥着潜在功能。
异黄酮是一种主要分布于豆科植物中的类黄酮，其糖基化主要是C-7位的O-葡糖基化，并且主要由异黄酮7-O-葡糖基转移酶(IF7GT)特异性催化形成[10]，不仅在豆科植物固氮根瘤形成中充当关键信号分子，而且还参与抵抗病原体感染的防御机制[11-12]。目前，仅在葛根(Pueraria lobata) [13]、甘草(Glycyrrhiza echinata) [14]、大豆(Glycine max)幼苗的根[15]和大豆种子[16]中分离获得，而从其他豆科植物中克隆的IF7GT还十分有限。
红豆草(Onobrychis viciifolia)，系豆科驴豆属草本植物，已在甘肃、青海、西藏等高原地区引种栽培多年[17]。前期试验对田间种植的红豆草转录组分析发现，类黄酮代谢通路在红豆草干旱环境适应中显著富集，进一步分析发现，参与类黄酮代谢的红豆草异黄酮7-O-葡糖基转移酶基因(OvIF7GT)的表达显著上调，提示OvIF7GT基因在红豆草干旱胁迫耐受中可能具有重要作用。本研究以红豆草为试验材料，利用RT-PCR技术克隆红豆草OvIF7GT基因，并对该基因进行生物信息学及亚细胞定位分析；此外，利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析该基因在红豆草幼苗中对干旱胁迫的响应表达情况，以期为后续深入探究OvIF7GT在红豆草抗旱中的功能提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
红豆草种子于2022年8月采自于青海省牧草良种繁殖场(100°39′ E，35°09′ N)，将颗粒饱满的种子去稃后分别用75%的无水乙醇和1%的次氯酸钠溶液进行表面消毒，然后置于铺有双层无菌滤纸的玻璃培养皿中并加入3 mL灭菌水，在植物光照培养箱中萌发，培养条件为：光照/黑暗16 h/8 h，温度23 ℃，湿度40%，每天更换新的无菌水。待种子萌发第7天，选取长势一致的幼苗定植于1/2 Hoagland营养液中继续培养，每3 d更换一次营养液。幼苗生长至第28天，以1/2 Hoagland营养液配制的15% PEG6000溶液模拟干旱胁迫，同时以不加PEG6000的营养液培养作为对照(CK)，对照和胁迫组各设置3个重复；分别取0、6、12、24、48和72 h干旱胁迫后的红豆草幼苗叶和根组织存放于−80 ℃冰箱，用于后续OvIF7GT的克隆和表达分析。
1.2 试验试剂及主要仪器
植物RNA提取试剂盒(TaKaRa，大连，Cat#9769)、cDNA反转录试剂盒(Takara，大连，Cat#6210A)、pMD19-T载体(Takara，大连，Cat#3271)、实时荧光定量试剂盒(Takara，大连，Cat#RR820A)、DNA片段凝胶回收试剂盒(B518141-0100，上海)、大肠杆菌E.coli DH5α(全式金生物技术有限公司，北京)、高保真聚合酶Prime STAR HS (Premix) (Takara，大连，Cat#R040Q)、荧光定量PCR试剂盒TB Green Premix Ex Taq II (Takara，大连，Cat#RR820A)。
超微量核酸蛋白测定仪(NanoPhotometer® NP80，IMPLEN)、凝胶成像仪(Universal Hood II，BIO-RAD)、实时荧光定量PCR仪(LightCycler®480‖，Roche)、激光共聚焦显微镜(NIKON A1R + ，日本尼康公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 RNA提取及cDNA链的合成
利用植物总RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取CK和干旱胁迫处理后红豆草叶和根组织的总RNA，然后利用Nanodrop检测RNA浓度和纯度；接着利用1.0%琼脂糖凝胶检测RNA完整性(1 × TAE缓冲液，120 V，25 min)，上样量3 μL (RNA 2 μL + Loading buffer 1 μL)；最后利用反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA链。将合成的cDNA放置于−20 ℃冰箱保存用于后续试验。
1.3.2 目的基因克隆
结合前期试验红豆草转录组数据OvIF7GT基因的序列信息，通过在线工具NCBI ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找出其完整的开放阅读框，利用Primer Premier 5.0设计目的基因特异性引物(表1)；以72 h干旱处理红豆草幼苗叶RNA反转录后的cDNA链为模板，进行PCR扩增。扩增体系(50 μL)为，cDNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL， PrimeSTAR HS (Premix) 25 μL，灭菌ddH2O 22.5 μL。反应程序为，预变性：94 ℃ 5 min；变性：94 ℃ 30 s，退火：50 ℃ 45 s，延伸：72 ℃ 90 s，共30个循环；延伸：72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的基因片段切胶回收，再连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆送金唯智测序公司进行测序。
表 1 红豆草OvIF7GT基因克隆及荧光定量PCR所用引物Table 1. Primers used for cloning and quantitative PCR of OvIF7GT in O. viciifolia引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)用途
ApplicationOvIF7GT-F GAAAGGATTAATGGTAGAGGCATTGTG 基因克隆
Gene cloningOvIF7GT-R CAAGACCGGCAACAGGATTCAATC yOvIF7GT-F AACACGGGGGACTTTGCAACATGGCTTCTTCCTCTTCTCGTTCG 亚细胞定位
Subcellular localizationyOvIF7GT-R CCTGAAGCGGCCGCTGTACAAGGATAAATCTCAATAAGGGACAACAATCCTGTC qOvIF7GT-F ATCATTACCACCTCCAACTT 荧光定量PCR
qRT- PCRqOvIF7GT-R GGATACCAGGCACAACAA ACTIN1-F TCCTATCTCACCTCTTATCCA 内参基因
Reference geneACTIN1-R CCATCCATTGTCCACGAA 1.3.3 OvIF7GT蛋白的生物信息学分析
利用在线生物信息分析软件(表2)分析OvIF7GT蛋白的等电点、亲疏水性、跨膜区、蛋白序列信号肽、二级结构及三级结构等理化性质。此外，在NCBI数据库中检索OvIF7GT的同源蛋白序列，利用DNAMAN软件对同源蛋白的氨基酸序列进行多重比对，然后以拟南芥作为外来群，基于最大似然法(maximum likelihood, ML)，使用MEGA X7软件构建不同物种IF7GT蛋白同源序列的系统发育进化树，Bootstrap设置为1 000。
表 2 生物信息学分析网站Table 2. Websites used for bioinformatics analysis用途
Function网址
Website保守结构域分析 Conservative domain analysis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi 蛋白质理化性质 Physicochemical properties of protein https://web.expasy.org/protparam 蛋白质的磷酸化位点 Phosphorylation sites of proteins https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1 蛋白质亲/疏水性分析 Protein hydrophilicity analysis https://web.expasy.org/protscale/ 蛋白质信号肽分析 Analysis of protein signal peptide www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1 蛋白质跨膜结构 Protein transmembrane structure www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 蛋白质二级结构预测 Protein secondary structure prediction https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html 蛋白质三级结构预测 Protein tertiary structure prediction https://swissmodel.expasy.org 1.3.4 OvIF7GT亚细胞定位
本研究先利用在线工具CELLO v.2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)预测OvIF7GT蛋白的亚细胞定位情况；其次通过瞬时表达试验验证该蛋白的表达定位，具体方法如下：用以含有目的基因的pMD19-T为模板，用yOvIF7GT-F和yOvIF7GT-R引物进行扩增(表1)，扩增产物利用Gibson assembly同源重组的方法将OvIF7GT亚克隆至pCAMBIA1300-GFP载体并测序，将测序正确的载体pCAMBIA1300-IF7GT-GFP转入农杆菌GV3101，挑取单克隆至LB液体培养基(含50 mg·L−1卡那霉素)中培养，菌液离心收集菌体后，用10 mmol·L−1 MgCl2 (含120 mmol·L−1 AS)悬浮液重悬菌体并调节OD600至0.6左右，然后将其注射烟草叶片下表皮，室温弱光培养48 h后用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号。
1.3.5 不同干旱胁迫时间下OvIF7GT在红豆草中的表达水平分析
根据OvIF7GT序列，设计OvIF7GT的qRT-PCR特异性引物(表1)，以CK和干旱处理6、12、24、48和72 h后红豆草叶和根组织cDNA为模板，进行qRT-PCR表达分析，并以ACTIN1 [18]作为内参基因，各处理设置3个重复。反应体系(20 μL)为：cDNA模板2 μL，TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL；反应程序为95 ℃ 30 s，9 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2−ΔΔCT方法[19]计算OvIF7GT基因相对表达量，利用Graphpad Prism 6软件对结果统计分析与绘图。
2. 结果与分析
2.1 OvIF7GT基因的克隆
结合前期的红豆草干旱胁迫转录组数据，获得一条注释为异黄酮-7-O-糖基转移酶基因(OvIF7GT)的转录本，利用ORF特异性引物对OvIF7GT基因进行扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测，获得一条特异性强、序列大小1 500 bp左右的基因片段(图1)。测序结果显示，该基因序列大小为1 512 bp，与预期目的基因片段大小相符，表明本研究成功克隆得到目的基因OvIF7GT (Genbank收录号为OQ914858)。
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图 1 红豆草OvIF7GT基因的PCR扩增M代表6 000 bp Marker，OvIF7GT为目的基因。Figure 1. PCR amplification of OvIF7GT gene in Onobrychis viciaefoliaM and OvIF7GT indicate the 6 000 bp Marker and interested gene, respectively.2.2 OvIF7GT蛋白的生物信息学分析
基于NCBI CD search在线工具对OvIF7GT基因编码的蛋白质进行分析，发现OvIF7GT蛋白由GTB型UDP糖基转移酶结构域、胸腺嘧啶二磷酸腺苷(TDP)结合位点、底物结合域和激活域组成(图2)。利用Expasy-ProtParam tool工具对OvIF7GT理化性质进行分析，结果显示：OvIF7GT共编码503个氨基酸，分子式为C2527H3991N675O749S30，相对分子质量为56 774.36 Da，理论等电点为5.51，不稳定系数为51.59，是一种酸性不稳定蛋白；脂肪系数为92.23，蛋白所带正负电荷残基数目分别为47和62，半衰期为30 h。
利用NetPhos在线软件预测了OvIF7GT基因编码蛋白质的磷酸化位点，结果显示OvIF7GT含有丝氨酸(Serine, Ser)位点最多，其次是苏氨酸(Threonine, Thr)位点和络氨酸(Tyrosine, Tyr)位点(图3A)，表明该蛋白在发生磷酸化时主要以丝氨酸磷酸化为主。通过该蛋白质的亲/疏水性分析(图3B)，显示亲水性最强的为277位，其最低分值−3.4；疏水性最强的为150位，其最高分值为2.6，总平均亲水性(GRA-VY)为−0.215，推测该蛋白质其为一种亲水性蛋白。蛋白质跨膜结构的预测结果表明OvIF7GT包含两个跨膜结构域(图3C)。Signal P 4.1 在线分析结果显示， OvIF7GT 多肽链中19号位丙氨酸残基信号肽分值（S-score）最高为 0.545， 第22位组氨酸残基的原始剪切位点分值（C-score） 最高为 0.259，并且其综合剪切位点分值（Y-score）也是最高，为 0.297（图 3D）。
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图 3 红豆草OvIF7GT磷酸化(A)、亲/疏水性(B)、跨膜结构域(C)及信号肽(D)分析C-score: 原始剪切位点分值；S-score：多肽链氨基酸残基信号肽分值；Y-score：最高综合剪切位点分值。图D的线条下字母表示氨基酸序列。Figure 3. Phosphorylation analysis (Panel A), hydrophilicity analysis (Panel B), transmembrane structure (Panel C), and signal peptide analysis (Panel D) of protein OvIF7GTC-score: the score representing the likelihood of the original cleavage site. S-score: the signal peptide score based on the amino acid residues of the polypeptide chain. Y-score: the highest integrated score for the cleavage site, combining multiple predictive parameters. The letters under the lines represent amino acid sequences in Figure D.2.3 OvIF7GT蛋白的结构预测
SOPMA软件对OvIF7GT的二级结构预测结果显示，该蛋白质含有41.75% α-螺旋、35.79%无规则卷曲、15.51%延伸链和6.96% β-折叠，表明该蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主(图4)。同时，利用SWISS-MODEL软件对OvIF7GT蛋白的三级结构进行预测，发现氨基酸序列相似性为41.18%，覆盖度为0.74；该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲为主，与二级结构预测结果一致(图4)。
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图 4 OvIF7GT蛋白三级结构预测Figure 4. Three-dimensional structure prediction of protein OvIF7GT2.4 OvIF7GT同源蛋白序列比对及系统发育进化关系分析
在NCBI数据库中对OvIF7GT蛋白的氨基酸序列进行同源搜索，然后利用DNAMAN软件对OvIF7GT蛋白序列同源性较高的蒺藜苜蓿、红车轴草(Trifolium pretense)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、相思子(Abrus precatorius)、豌豆(Pisum sativum)和大豆等12个物种同源序列进行比对，发现OvIF7GT与蒺藜苜蓿(XP_003625715.1)、鹰嘴豆(XM_004494036.3)和红车轴草(XP_045798308.1)中的同源蛋白氨基酸序列相似度最高，分别为73.99%、72.20%和70.77%，推测它们可能具有类似的生物学功能(图5)。此外，蛋白同源序列比较发现，在序列C端含有一段约40个氨基酸残基的植物次级代谢产物糖基转移酶(plant secondary product glycosyltransferase box，PSPG)保守序列(图5)。系统发育进化关系分析结果显示，OvIF7GT与蒺藜苜蓿和鹰嘴豆聚为一支系，表明它们具有更近的亲缘关系(图6)。
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图 5 OvIF7GT同源蛋白序列比对OvIF7GT：红豆草；XM_004494093.1：鹰嘴豆；XP_003625715.1：蒺藜苜蓿；XP_028777126.1：牧豆树；XP_045798308.1：红车轴草；KAI5425741.1：豌豆；KAG5043823.1：野大豆；XP_007162809.1：芸豆；KAG4928355.1：大豆；KOM29264.1：赤豆；XP_020239052.1：木豆；XP_015931666.1：金花生；XP_027365711.1：相思子。Figure 5. Sequence alignments of OvIF7GT homologous proteinsOvIF7GT: O. viciaefolia; XM_004494093.1: Cicer arietinum; XP_003625715.1: Medicgo truncatula; XP_028777126.1: Prosopis alba; XP_045798308.1: Trifolium pratense; KAI5425741.1: Pisum sativum; KAG5043823.1: Glycine soja; XP_007162809.1: Phaseolus vulgaris; KAG4928355.1: Glycine max; KOM29264.1: Vigna angularis; XP_020239052.1: Cajanus cajan; XP_015931666.1: Arachis duranensis; XP_027365711.1: Abrus precatorius.2.5 OvIF7GT亚细胞定位分析
本研究首先利用在线工具CELLO v.2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)预测OvIF7GT蛋白亚细胞定位，结果表示该蛋白在细胞质中表达。为了进一步验证预测结果，本研究通过构建含有GFP荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1300-IF7GT-GFP，并侵染烟草(Nicotiana tabacum)叶片进行瞬时表达分析，从图7中可以看出，绿色荧光信号主要存在于细胞质中，但是也有少量存在于细胞核中，表明OvIF7GT蛋白主要在细胞质中发挥功能。
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图 7 OvIF7GT的亚细胞定位A：含有目的基因的载体pCAMBIA1300-IF7GT-GFP；B：空载体pCAMBIA1300-GFP。Figure 7. Subcellular localization of OvIF7GTA: pCAMBIA1300-IF7GT-GFP with the cloned gene; B: empty vector pCAMBIA1300-GFP without the cloned gene.2.6 不同干旱胁迫时间下红豆草叶和根中OvIF7GT的表达分析
本研究通过qRT-PCR检测了OvIF7GT在红豆草幼苗不同时间干旱胁迫下的表达水平，结果显示(图8)，随着干旱胁迫时间的增加，该基因在红豆草幼苗叶中的表达呈现升高、降低、再升高的趋势，并且相较于CK，干旱胁迫48 h后该基因的相对表达量显著升高(P < 0.001)；而在根中，该基因的表达在干旱胁迫48 h内的相对表达量未发生明显变化，但是在干旱处理72 h后其相对表达量也显著提高(P < 0.001)。此外，在干旱处理72 h后，OvIF7GT在红豆草幼苗叶中的相对表达量(2.48倍)也明显高于根组织(1.54倍)。结果表明，红豆草幼苗中OvIF7GT的表达受到干旱胁迫的诱导，并且参与红豆草对干旱胁迫的响应。
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图 8 不同干旱胁迫时间下红豆草OvIF7GT在不同组织中的表达水平*和***分别表示CK和干旱处理组之间的差异显著性水平为P < 0.05和P < 0.001。Figure 8. Relative expression levels of OvIF7GT in different tissues of O. viciifolia under different drought stress time*and *** indicate that the statistically significant differences between CK and drought stress treatment at 0.05 and 0.001 levels, respectively.3. 讨论
干旱是影响高寒地区牧草生长发育及其生产性能的主要环境胁迫因子之一[20]，通过发掘干旱胁迫响应基因选育优良高寒牧草品种，是高寒地区牧草产业及畜牧业可持续发展亟待解决的瓶颈问题。类黄酮作为植物中最大的次级代谢产物类型之一，其生物合成和积累在植物环境胁迫耐受中具有重要作用，而这一活性或功能往往依赖于其结构的糖基化修饰[21]。前期研究揭示了类黄酮对于红豆草适应高海拔地区干旱环境的潜在作用，并且发现了一个显著上调表达的异黄酮糖基化修饰酶编码基因OvIF7GT，本研究成功克隆了该基因，生物信息分析表明该基因编码蛋白具有GT-B型糖基转移酶超家族的保守结构域，由α-螺旋和无规则卷曲构成的二级与三级结构特征，与植物大部分编码糖基转移酶的特性相似，如葡萄GT1、拟南芥UGT72B1和苜蓿UGT71G1、UGT78G1等[22]，并且OvIF7GT具有一个PSPG box保守结构域，而这个结构域是不同植物中糖基转移酶的保守序列[23]，进一步说明了OvIF7GT具有催化糖基转移的功能，并且其PSPG box保守序列中最后一个氨基酸残基是谷氨酰胺，推测该酶利用的糖基供体是UDP-葡萄糖[24]。此外，通过系统发育关系分析，红豆草与蒺藜苜蓿和鹰嘴豆亲缘关系最近(图6)，OvIF7GT基因可能与这两个物种中的同源基因功能相似，但是在这两个物种中尚未分离得到IF7GT基因，虽然从豆科植物中尤其是大豆中已克隆了多个IF7GT基因，并体外考察了其编码蛋白的催化特性[25]，但是物种之间的差异，可能导致同源蛋白催化功能以及植物生理功能上存在差异。
蛋白质在细胞中的表达分布与其在细胞内的分子功能具有紧密关系[26]，本研究通过亚细胞定位预测和烟草中的瞬时表达验证，揭示OvIF7GT主要存在于细胞质中，但在细胞核中也有少量分布，这与黄牡丹中类黄酮糖基化酶的亚细胞定位相一致[27]，但是大多数的类黄酮糖基转移酶一般表达于蛋白质[28]，如山葡萄(Vitis amurensis) [29]、紫花苜蓿中的UGT，这可能与植物中糖基转移酶一般在细胞质中具有更高的生物活性有关，而且类黄酮的生物合成和修饰也主要在细胞质中发生[30]。
干旱胁迫往往引起包括糖基转移酶编码基因在内的类黄酮生物合成相关基因的上调表达[31]，进而导致植物体内类黄酮的积累，这一过程对于植物缓解干旱引起的氧化损伤具有重要作用，并且通过体内过表达试验也得到证实，如拟南芥UGT76E11基因过表达植株具有更强的环境胁迫抗氧化能力[32]；拟南芥中过表达AtUGT74E2或AtUGT75D1基因均可显著提高其对盐和干旱胁迫的耐受性[33]，说明糖基转移酶基因参与植物逆境胁迫应答调控。对于UGT基因在植物非生物胁迫处理后的表达分析已有较多报道，如宗宪春等[34]研究发现，干旱胁迫处理下小麦(Triticum aestivum) TaGT157基因在F1代中相对表达量比在父本和母本中的相对表达量高，且F1代小麦抗旱能力较父本有所提高在木豆中，CcUGT基因在叶片中的表达量高于其他组织，而在根中CcUGT69和CcUGT110基因分别受到盐和低温的诱导表达[35]，这些研究表明，UGT基因的表达不仅跟受到的环境胁迫类型相关，而且具有明显的组织特异性。在本研究中，OvIF7GT在不同时间干旱胁迫的红豆草幼苗根和叶中的表达模式不同，这与番茄(Solanum lycopersicum)中SlUGT75C1-like基因干旱胁迫下表达规律具有相似性[36]，但随着干旱胁迫时间的延长，尤其是干旱处理72 h后，该基因在两个组织部位的相对表达量都显著提高，说明OvIF7GT的表达不仅受到干旱胁迫诱导，而且具有一定的时空特异性，推测干旱可能引起糖基化类黄酮的积累以抵御干旱不利影响，同时也提示该基因在红豆草抗旱中可能具有重要功能，这一过程值得进一步深入研究。
4. 结论
本研究从红豆草幼苗中成功克隆了一个干旱胁迫响应的异黄酮-7-O葡萄糖基转移酶基因OvIF7GT，属于GT-B型糖基转移酶家族，与蒺藜苜蓿和鹰嘴豆中的同源蛋白具有较近的亲缘关系。烟草瞬时表达分析表明，OvIF7GT主要定位于细胞质中，少量存在于细胞核中。此外，红豆草幼苗中OvIF7GT基因的表达受到干旱胁迫诱导，并表现出特异的时空特异性。该研究结果不仅为深入研究该基因的植物抗旱功能提供了依据，而且为耐旱红豆草分子设计育种提供了新的靶点。
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图 1 红豆草OvIF7GT基因的PCR扩增
M代表6 000 bp Marker，OvIF7GT为目的基因。
Figure 1. PCR amplification of OvIF7GT gene in Onobrychis viciaefolia
M and OvIF7GT indicate the 6 000 bp Marker and interested gene, respectively.
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图 3 红豆草OvIF7GT磷酸化(A)、亲/疏水性(B)、跨膜结构域(C)及信号肽(D)分析
C-score: 原始剪切位点分值；S-score：多肽链氨基酸残基信号肽分值；Y-score：最高综合剪切位点分值。图D的线条下字母表示氨基酸序列。
Figure 3. Phosphorylation analysis (Panel A), hydrophilicity analysis (Panel B), transmembrane structure (Panel C), and signal peptide analysis (Panel D) of protein OvIF7GT
C-score: the score representing the likelihood of the original cleavage site. S-score: the signal peptide score based on the amino acid residues of the polypeptide chain. Y-score: the highest integrated score for the cleavage site, combining multiple predictive parameters. The letters under the lines represent amino acid sequences in Figure D.
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图 4 OvIF7GT蛋白三级结构预测
Figure 4. Three-dimensional structure prediction of protein OvIF7GT
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图 5 OvIF7GT同源蛋白序列比对
OvIF7GT：红豆草；XM_004494093.1：鹰嘴豆；XP_003625715.1：蒺藜苜蓿；XP_028777126.1：牧豆树；XP_045798308.1：红车轴草；KAI5425741.1：豌豆；KAG5043823.1：野大豆；XP_007162809.1：芸豆；KAG4928355.1：大豆；KOM29264.1：赤豆；XP_020239052.1：木豆；XP_015931666.1：金花生；XP_027365711.1：相思子。
Figure 5. Sequence alignments of OvIF7GT homologous proteins
OvIF7GT: O. viciaefolia; XM_004494093.1: Cicer arietinum; XP_003625715.1: Medicgo truncatula; XP_028777126.1: Prosopis alba; XP_045798308.1: Trifolium pratense; KAI5425741.1: Pisum sativum; KAG5043823.1: Glycine soja; XP_007162809.1: Phaseolus vulgaris; KAG4928355.1: Glycine max; KOM29264.1: Vigna angularis; XP_020239052.1: Cajanus cajan; XP_015931666.1: Arachis duranensis; XP_027365711.1: Abrus precatorius.
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图 7 OvIF7GT的亚细胞定位
A：含有目的基因的载体pCAMBIA1300-IF7GT-GFP；B：空载体pCAMBIA1300-GFP。
Figure 7. Subcellular localization of OvIF7GT
A: pCAMBIA1300-IF7GT-GFP with the cloned gene; B: empty vector pCAMBIA1300-GFP without the cloned gene.
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图 8 不同干旱胁迫时间下红豆草OvIF7GT在不同组织中的表达水平
*和***分别表示CK和干旱处理组之间的差异显著性水平为P < 0.05和P < 0.001。
Figure 8. Relative expression levels of OvIF7GT in different tissues of O. viciifolia under different drought stress time
*and *** indicate that the statistically significant differences between CK and drought stress treatment at 0.05 and 0.001 levels, respectively.
表 1 红豆草OvIF7GT基因克隆及荧光定量PCR所用引物
Table 1 Primers used for cloning and quantitative PCR of OvIF7GT in O. viciifolia
引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)用途
ApplicationOvIF7GT-F GAAAGGATTAATGGTAGAGGCATTGTG 基因克隆
Gene cloningOvIF7GT-R CAAGACCGGCAACAGGATTCAATC yOvIF7GT-F AACACGGGGGACTTTGCAACATGGCTTCTTCCTCTTCTCGTTCG 亚细胞定位
Subcellular localizationyOvIF7GT-R CCTGAAGCGGCCGCTGTACAAGGATAAATCTCAATAAGGGACAACAATCCTGTC qOvIF7GT-F ATCATTACCACCTCCAACTT 荧光定量PCR
qRT- PCRqOvIF7GT-R GGATACCAGGCACAACAA ACTIN1-F TCCTATCTCACCTCTTATCCA 内参基因
Reference geneACTIN1-R CCATCCATTGTCCACGAA 
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表 2 生物信息学分析网站
Table 2 Websites used for bioinformatics analysis
用途
Function网址
Website保守结构域分析 Conservative domain analysis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi 蛋白质理化性质 Physicochemical properties of protein https://web.expasy.org/protparam 蛋白质的磷酸化位点 Phosphorylation sites of proteins https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1 蛋白质亲/疏水性分析 Protein hydrophilicity analysis https://web.expasy.org/protscale/ 蛋白质信号肽分析 Analysis of protein signal peptide www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1 蛋白质跨膜结构 Protein transmembrane structure www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 蛋白质二级结构预测 Protein secondary structure prediction https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html 蛋白质三级结构预测 Protein tertiary structure prediction https://swissmodel.expasy.org
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