添加中、微量元素及组合对促生菌剂促生特性的影响研究
为筛选可提升促生菌剂有效活菌数和促生特性的营养元素，本文通过在促生菌剂中添加不同种类和浓度的中、微量元素及其组合，探索不同元素的最佳添加量及添加后对菌剂有效活菌数、固氮酶活性、溶磷能力和分泌吲哚乙酸(IAA)的影响。结果表明：1)当钼、硼、锰和镁添加浓度分别为100、100、5和10 mg·L−1时，菌剂的有效活菌数较未添加分别增加了23.53%、77.65%、81.88%和148.71%。2)正交试验表明，最佳组合为A-1B0C0D-1，即钼50 mg·L−1、锰5 mg·L−1、镁10 mg·L−1和硼50 mg·L−1，其中硼元素起主导作用。3)通过测定单一元素及不同组合对促生菌剂促生特性的研究结果显示，单一元素或不同元素组合添加对菌剂的固氮酶活性、溶磷能力和分泌IAA能力均存在不同程度的影响。综合评价得出，影响菌剂促生特性综合能力表现为：单一元素处理中，添加5 mg·L−1锰的处理表现最优；添加元素组合的处理中，组合A5 (钼100 mg·L−1、硼150 mg·L−1、锰5 mg·L−1、镁5 mg·L−1)最优。本研究结果可用于完善促生菌剂的配方。
English
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近年来，农业微生物的研究和应用已成为加快农业创新发展、提升农业科技竞争力的主导力量，国际农业强国已将微生物组列入农业领域五大亟待突破的方向之一[1]。微生物肥料作为安全环保无公害的新型生物产品，有望成为化肥的主要替代品。微生物肥料主要通过肥料中功能微生物的新陈代谢实现固氮、溶磷、分泌激素等作用或通过诱导植物体产生吲哚乙酸IAA，活化土壤养分，增加植物营养元素供应量等，从而直接或间接促进植物生长[2-3]。
作为一种生物产品，微生物肥料的施用效果会受到土壤环境、气候条件、作物种类等因素的影响，存在促生效果不佳或者不稳定的情况[4-5]，因而如何有效提高微生物肥料的施用效果成为当下研究的重点。目前，对微生物肥料的研究主要集中在高效促生菌株的筛选及其特性的测定方面，关于微生物肥料高效配方及养分强化的相关研究较少。因此，筛选可提升促生菌剂施用效果，完善复合菌剂配方，进而获得高效微生物肥料产品显得尤为重要。
中、微量元素作为微生物生长和发育必需的营养物质，对微生物的生长和代谢具有促进作用[6]。前期研究表明，钼是固氮酶中钼铁蛋白的组分之一，在固氮酶的活性调节中具有重要作用，钼的缺少会降低生物固氮能力[7]；硼是固氮菌固氮不可缺少的元素之一，且多数研究证明在硼存在的条件下，微生物的固氮能力会增强[8]；此外，Gao等[9]研究发现，适宜浓度下，Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+对多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的增殖均有促进作用。目前关于中微量元素对于促生菌作用的研究主要集中在单一元素添加至培养基后对单一菌株的影响，而对于中、微量元素在促生菌剂中添加的研究较少。基于此，本研究拟将4种元素(钼、硼、锰和镁)添加至促生菌剂中，研究不同元素及其组合的加入是否影响菌剂的促生能力，以期筛选可增强促生菌剂特性的中、微量元素，进一步完善菌剂配方，提升菌剂的使用效果，为我国农业生产提供优质高效的微生物肥料。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌剂
供试菌剂由甘肃农业大学草地应用微生物团队提供，分别由蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides) CY1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CY3、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha) CM1按照一定比例(配方正在申请专利)混合后制得的复合菌剂。
1.1.2 供试中、微量元素
供试元素为硼(H3BO3)、钼[(NH4)6Mo7O24·4H2O]、镁(MgSO4·7H2O)和锰(MnSO4·H2O)，均购于国药集团有限公司。
1.1.3 供试培养基
LB液体培养基用于菌株活化、菌剂制备和IAA含量测定，无氮培养基[10] (nitrogen free medium, NFM)用于测定菌剂的固氮酶活性；无磷培养基[11] (pikovskaky, PKO)用于菌剂溶磷能力的测定。
1.2 研究方法
1.2.1 中、微量元素最佳添加浓度筛选
将中、微量元素各配制为100 mL母液待用。将促生菌剂放置于180 r·min−1、28 ℃恒温摇床振荡培养，48 h后调节菌液OD600 = 2.0 ± 0.02，添加至促生菌剂中将母液稀释为不同浓度梯度的稀释液，均取1 mL添加至上述菌剂中制成含不同元素不同浓度(如：添加1 mL的硼酸，使菌剂中硼含量分别为0、10、50、100、200 mg·L−1)的复合菌剂 (表1)，添加等体积无菌去离子水作为对照，放置于180 r·min−1、28 ℃恒温摇床振荡培养，测定不同时间OD600值，选择OD600最高的浓度处理作为最佳添加量[9]。
表 1 中、微量元素添加浓度梯度设置Table 1. Medium and trace element mixture add concentration gradient setting类型
Type名称
Name添加浓度
Concentration
gradient/(mg·L−1)微量元素
Trace element(NH4)6Mo7O24·4H2O 0, 20, 50, 100, 200 MnSO4·H2O 0, 5, 10, 20, 50 H3BO3 0, 10, 50, 100, 200 中量元素
Medium elementMgSO4·7H2O 0, 5, 10, 20, 50 1.2.2 4种元素筛选结果验证及不同处理菌剂有效活菌数测定
将1.2.1中筛选的最佳浓度添加至促生菌剂，通过测定有效活菌数验证1.2.1中的筛选结果，同时通过测定不同时间的OD600值探究不同元素最佳添加后对促生菌剂OD值的影响。有效活菌数测定参考国家标准GB 20287－2006《农用微生物菌剂》 [12]，每个处理3次重复。
1.2.3 4种元素组合对促生菌剂OD600的影响
本文采用4因素3水平L9(34)正交表(表2)，以钼、硼、锰和镁的质量浓度为4个因素，以0水平对应值为中间值设置3个水平共计9个组合进行正交试验，正交试验后从表中选择OD值最高的3个组合进行后续研究。
表 2 正交试验设计Table 2. Orthogonal experimental design因素
Factor水平 Factor level −1 0 1 A: (NH4)6Mo7O24·4H2O 50 100 150 B: MnSO4·H2O 1 5 9 C: MgSO4·7H2O 5 10 15 D: H3BO3 50 100 150 1.2.4 4种元素及其组合对促生菌剂促生特性的影响
筛选的4种单一元素及3种组合分别为A2 (钼150 mg·L−1，硼50 mg·L−1，锰5 mg·L−1，镁15 mg·L−1)、A5 (钼100 mg·L−1，硼150 mg·L−1，锰5 mg·L−1，镁5 mg·L−1)和A6 (钼100 mg·L−1，硼50 mg·L−1，锰9 mg·L−1，镁10 mg·L−1)，将其按照最佳添加浓度添加至促生菌剂中制成含不同浓度不同元素的复合菌剂。
菌剂固氮特性测定参照王振龙等[10]的方法：将培养24 h后的菌剂吸取200 µL菌液接种于盛有半固体NFM培养基中，以不接菌培养基为对照，28 ℃培养48 h后将棉花塞换成橡胶塞，用无菌注射器抽出1 mL气体并注入1 mL乙炔，28 ℃培养48 h后用气象色谱仪(Agilent 7890A，美国)测定C2H4出峰时间及峰面积百分比，计算固氮酶活性。
菌剂溶磷特性测定参照Liu等[11]的方法：将制备好的菌液接种于装有20 mL PKO液体培养基的锥形瓶中，放置于28 ℃、180 r·min−1条件下培养12 d后，测定其pH后，离心，取上清液1 mL与19 mL NaHCO3溶液混合后，置于摇床摇动30 min。准确吸取滤液5 mL，再加入5 mL钼锑抗显色液于50 mL容量瓶中。用紫外可见光分光光度计测定OD60，参照标准曲线计算溶磷量。
菌剂分泌IAA特性测定参照姚拓[13]的方法：采用Salkowski比色法，将培养后的菌液接种于装有20 mL液体培养基的锥形瓶中，摇床培养10 d后，吸取10 mL离心，取上清液5 mL加5 mL S2比色液，暗处理30 min后迅速用分光光度计测定530 nm下的吸光值，在标准曲线上查出待测液的IAA浓度。
1.3 数据分析
采用SPSS进行正交试验设计并进行极差和方差分析，用平均值±标准误表示测定结果，使用SPSS PRO进行数据标准化处理，并以熵权法计算各指标的权重并排序，用Origin 2022软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 4种元素最佳添加量筛选
不同种类和浓度的中、微量元素添加对菌剂的OD值影响不同(图1)。与未添加元素相比，添加钼后0～8 h内处理间无明显差异，超过8 h后未添加钼的菌液OD值逐渐下降，其余处理则仍处于上升趋势；当培养时间超过16 h时，添加100 mg·L−1钼的菌剂OD值仍处于上升趋势，其余处理则开始下降；此后添加100 mg·L−1钼的菌剂OD值均高于其他处理，效果最优(图1A)。硼添加后，菌剂的OD值呈现先升高后降低的趋势，在0～8 h处理间无明显差异，超过8 h后添加50 mg·L−1和未添加硼的菌液OD值开始下降，当培养时间超过16 h时，添加100 mg·L−1硼的菌剂OD值均高于其他浓度，效果最优(图1B)。
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图 1 4种元素不同浓度添加对菌剂OD600的影响A、B、C、D图分别为钼、硼、锰和镁元素添加量筛选。Figure 1. Effects of the addition of four elements on the microbial inoculant OD600Figure A, B, C and D show the content screening of elements Mo, B, Mn, and Mg, respectively.与未添加相比，锰添加后菌剂OD值表现为低浓度升高，高浓度下降(图1C)。当添加浓度为0～20 mg·L−1时，培养0～16 h间菌剂的OD值逐渐升高，其中添加量为5 mg·L−1的处理最高，其余处理均低于未添加；当超过24 h后，OD值均开始下降；培养时间延长至40 h时，处理间无明显差异，但添加5 mg·L−1仍高于未添加，因此选择5 mg·L−1作为最佳添加量。同理，菌剂添加镁(图1D)培养至8 h时，各处理的OD值均高于未添加，随着培养时间的延长，各处理菌剂的OD值均开始降低，且趋势一致，其中添加量为10 mg·L−1的菌剂OD值最高，因此选择该浓度进行后续试验。
2.2 4种元素筛选结果验证及不同处理菌剂有效活菌数测定
4种元素分别以最佳添加量添加后，菌剂的OD值均表现为先升高后降低的趋势(表3)。当培养至24 h时各菌剂间无显著差异(P > 0.05)，培养至48 h时添加5 mg·L−1锰的菌剂OD值最高；培养至72 h，5 mg·L−1锰处理的菌剂OD值显著高于其他处理(P < 0.05)；培养时间延长至84 h时，添加了中、微量元素的菌剂OD值均高于CK，其中添加了5 mg·L−1锰的处理最高，且显著高于CK (P < 0.05)；当培养时间延长至108 h时，除添加了钼和镁的菌剂，其余处理的OD值均显著高于CK (P < 0.05)，由此可见，添加5 mg·L−1锰的菌剂OD效果最优。
表 3 4种元素最适添加条件下对菌剂OD600的影响Table 3. The influence of four elements on the microbial inoculant OD600 under optimal amendment conditions时间
Time/h0 (CK) 100 mg·L−1 H3BO3 100 mg·L−1 (NH4)6Mo7O24 5 mg·L−1 MnSO4 10 mg·L−1 MgSO4 0 2.112 ± 0.004Fa 2.107 ± 0.004Fa 2.113 ± 0.006Fa 2.107 ± 0.005FGa 2.120 ± 0.005Ea 12 2.682 ± 0.003Abc 2.664 ± 0.008Ac 2.706 ± 0.009Aa 2.724 ± 0.006Aa 2.686 ± 0.001Ab 24 2.567 ± 0.004Ba 2.573 ± 0.025Ba 2.578 ± 0.010Ba 2.600 ± 0.023Ba 2.562 ± 0.002Ba 36 2.474 ± 0.001Cb 2.454 ± 0.004Cc 2.475 ± 0.010Cb 2.496 ± 0.001Ca 2.475 ± 0.001BCb 48 2.427 ± 0.008Cbc 2.406 ± 0.004CDc 2.442 ± 0.009CDab 2.468 ± 0.005Da 2.420 ± 0.012Cbc 60 2.366 ± 0.009Dab 2.352 ± 0.024Db 2.376 ± 0.006Dab 2.406 ± 0.013Da 2.381 ± 0.001Cab 72 2.241 ± 0.014Eb 2.244 ± 0.035Eb 2.244 ± 0.008Eb 2.317 ± 0.027Ea 2.248 ± 0.000Db 84 2.055 ± 0.009Gb 2.105 ± 0.046Fab 2.074 ± 0.005Fb 2.184 ± 0.043Fa 2.096 ± 0.014Eb 96 1.849 ± 0.030Hb 2.018 ± 0.034Ga 1.920 ± 0.047Gab 2.073 ± 0.043Ga 1.998 ± 0.082Fab 108 1.886 ± 0.370Hb 2.061 ± 0.413Ga 1.975 ± 0.569Gab 2.098 ± 0.040Ga 1.980 ± 0.057Fab 同列不同大写字母表示相同处理在不同时间差异显著(P < 0.05)，同行不同小写字母表示相同时间不同处理间差异显著(P < 0.05)；下表同。
Different capital letters within the same column indicate significant differences for the same treatment among different times at the 0.05 level, and different lowercase letters within the same row indicate significant differences for the same treatment among different times at the 0.05 level; This is applicable for the following tables as well.与CK相比，添加5 mg·L−1的锰可显著提高菌剂有效活菌数(P < 0.05)，添加100 mg·L−1的钼、100 mg·L−1的硼和10 mg·L−1的镁后菌剂的有效活菌数分别较CK增加了23.53%、77.65%、81.88% (P > 0.05)，与前期筛选结果一致(图2)。
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图 2 单一中、微量元素对促生菌剂有效活菌数的影响CK表示未添加中微量元素；Mo代表钼元素；Mn代表锰元素；Mg代表镁元素；B代表硼元素，下图同。Figure 2. Effects of single medium and trace elements on the effective viable number of microbial inoculantsCK indicates that no trace element is added; Mo stands for molybdenum; Mn stands for manganese; Mg stands for magnesium; B stands for boron. This is applicable for the following figure as well.2.3 4种元素组合对促生菌剂的影响
单因素试验发现，不同元素添加对促生菌剂促进作用不同，为考察各因素之间的关系及影响，进一步优化各因素的最佳添加量，单选取各元素最佳的添加浓度范围进行正交试验(表4)及方差分析(表5)。依据R值判断，影响菌剂增殖的因素顺序为D > C > A > B，4个因素对菌剂OD值的影响均极显著(P < 0.01)。因此，综合极差分析和方差分析，促生菌剂添加中、微量元素最佳组合为A−1B0C0D−1，即50 mg·L−1钼、5 mg·L−1锰、10 mg·L−1镁和50 mg·L−1硼。挑选最优的A2、A5和A6 3个组合进行初步试验发现，A6最优。通过后期进一步验证，测得添加A6后菌剂的OD值为2.540，较正交结果降低了3.52%，偏差结果在可接受范围内。
表 4 正交试验及极差分析结果Table 4. Results of orthogonal test and range analysis序号
Number(NH4)6Mo7O24
(A)MnSO4
(B)MgSO4
(C)H3BO3
(D)OD600 A1 1 −1 0 1 2.484 A2 1 0 1 −1 2.517 A3 1 1 −1 0 2.391 A4 0 −1 1 0 2.452 A5 0 0 −1 1 2.517 A6 0 1 0 −1 2.540 A7 −1 −1 −1 −1 2.497 A8 −1 0 0 0 2.514 A9 −1 1 1 1 2.508 K1 2.506 2.478 2.468 2.518 K2 2.503 2.516 2.513 2.452 K3 2.464 2.480 2.492 2.503 R2 0.042 0.032 0.045 0.066 主次顺序 Primary
and secondary orderD > C > A > B 最优水平
Optimal levelA−1B0C0D−1 Ki为各因素同一水平试验指标之和，i = 1, 2, 3；R为极差，计算方法是各因素Ki的最大值减去Ki的最小值；表中“0、−1、1”表示表2正交试验设计中水平编号。
Ki is the sum of test indexes at the same level of all factors, i = 1, 2, 3; R is the range, calculated by subtracting the minimum Ki value from the maximum Ki value of each factor; “0, −1, 1” in the table indicate the horizontal numbers in the orthogonal test design shown in Table 2.表 5 方差分析结果Table 5. Results of variance analysis项目
Item平方和(SS)
Sum of
squares自由度(df)
Degree of
freedom均方(MS)
Mean
squareF P A 0.010 2 0.005 10.342 *** B 0.008 2 0.004 8.637 *** C 0.009 2 0.004 9.252 *** D 0.021 2 0.011 22.090 *** Error 0.009 18 0.000 R2 = 0.848，调整后R2 = 0.781；***表示P < 0.01。
R2 = 0.848, adjusted R2 = 0.781; ***, P < 0.01.2.4 4种元素及其组合对促生菌剂促生特性的影响
添加4种元素均可提高菌剂固氮酶的活性，与CK相比，添加硼、锰和镁后，菌剂的固氮酶活性显著高于CK (P < 0.05)，添加钼对菌剂固氮酶活性较CK可提高25.55% (P > 0.05) (图3A)。当4种元素组合后，与CK相比，组合A2、A5和A6对菌剂固氮酶活性无显著提升作用(P > 0.05) (图3A)。单一元素与4种元素组合相比，促生菌剂添加单一元素对固氮酶活性的提升效果强于元素组合A2。
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图 3 不同元素及其组合对促生菌剂促生特性的影响图中A2、A5、A6表示表4正交试验中的组合2、组合5、组合6。Figure 3. Effects of different elements and their combinations on growth-promoting properties of microbial inoculantsA2, A5, and A6 in the figure represent combination 2, combination 5, and combination 6 shown in the orthogonal test in Table 4.与CK相比，添加单一中微量元素后对菌剂分泌IAA的影响不同(图3B)，添加锰可显著提升菌剂分泌IAA的能力(P < 0.05)，添加硼和镁则对菌剂分泌IAA有所抑制(P > 0.05)。当4种元素组合后发现，组合A6可显著提升菌剂分泌IAA的能力。3种元素组合间相比较，A6显著优于A2和A5 。
与CK相比，单一中微量元素添加对菌剂溶有机磷无显著影响，其中，添加钼和镁对菌剂溶解有机磷的能力具有一定的抑制作用(P > 0.05)，而锰添加后菌剂溶有机磷能力较CK可提升11.50% (图3C)。当4种元素组合后，与CK相比，组合A5可提升菌剂溶解有机磷的能力，较CK可提升142.46% (P < 0.05)，A6和A2无显著影响(P > 0.05) (图3C)。单一元素处理间相比，添加锰的效果显著优于添加镁；3种组合间相比，A5最优。此外，测量菌液的pH发现，菌剂均为酸性，pH介于3～4，与菌剂溶有机磷能力无显著相关性(图3C)。
与CK相比，添加单一元素硼、锰和镁可提升菌剂溶解无机磷的能力，其中添加硼提升作用显著(P < 0.05)，添加钼则抑制了菌剂溶无机磷的能力(P < 0.05) (图3D)。4种元素组合后，组合A5和A6可显著提升菌剂溶无机磷能力(P < 0.05)。单一元素与组合相比较，A6效果最优。此外，测量菌液的pH发现，菌剂均为酸性，其中添加钼元素后菌剂的pH显著高于(P < 0.05)其他处理(图3D)。同时，pH与菌剂的溶无机磷能力呈现显著负相关性，即pH越低，溶无机磷的能力越强。
2.5 4种元素及其组合对促生菌剂促生特性的综合评价
将数据标准化处理后进行权重计算，固氮酶标准化的权重为27.437%，无机磷标准化的权重为10.607%，IAA标准化的权重为30.803%，有机磷标准化的权重为31.15% (表6)。其中，溶有机磷能力的权重较其他性状权重占比高，说明在各不同处理中，添加不同元素及组合后菌剂的溶有机磷能力的数据差异性较大，相对于其他促生特性，对评价结果有更大的影响。
表 6 各处理的权重分析结果Table 6. Weight analysis results of each process项目
Item信息熵值e
Information entropy value e信息效用值d
Information utility value d权重
Weight/%无机磷含量 Inorganic phosphorus content 0.931 0.069 10.607 固氮酶活性 Nitrogen fixing enzyme activity 0.822 0.178 27.437 IAA 含量 IAA content 0.800 0.200 30.803 有机磷含量 Organic phosphorus content 0.798 0.202 31.153 综合4种菌剂的能力分析发现，与CK相比，菌剂添加单一中微量元素及其组合后，对菌剂综合能力影响排序为锰 > A5 > A6 > 硼 > 钼 > 镁 > A2；其中单一元素最优为锰，组合最优为A5 (表7)。
表 7 不同元素及其组合对促生菌剂促生特性影响的综合排名Table 7. Comprehensive ranking of the effects of different elements and their combinations on the growth-promoting properties of microbial inoculants处理
Treatment综合评价
Comprehensive evaluation排名
RankingCK 0.241 7 B 0.474 4 Mo 0.322 5 Mn 0.601 1 Mg 0.241 6 A2 0.126 8 A5 0.587 2 A6 0.511 3 3. 讨论
3.1 单一元素及组合添加对促生菌剂OD值及有效活菌数的影响
中、微量元素作为生物生长的必需物质，对于微生物的生长具有十分重要的意义。不同种类的中、微量元素对微生物的影响不同，同一种中、微量元素对不同微生物的影响也不同[6]。本研究通过将不同浓度的中、微量元素添加至促生菌剂发现，低浓度时可促进菌株增殖，但到达一定浓度后其效果开始减弱甚至表现为抑制，其中，当钼、硼、锰和镁4种元素浓度分别为100、100、5和10 mg·L−1时对菌剂的效果最好。此外，本研究在不同供试元素各自最适添加量条件下进行较长时间培养发现，随着培养时间延长至96 h，各处理的OD值均高于CK。通过计算活菌数发现，添加4种元素均可提升菌剂的有效活菌数，推测是添加一定量营养元素后，菌剂中的营养物质提升，使菌剂中的菌株可以更好地生长，从而提升有效活菌数，这与多粘类芽孢杆菌[9]和内生根瘤菌[14]在添加趋势和浓度的研究结果类似，其中部分浓度存在差异，其原因可能是不同微生物对元素的利用和适应能力不同。
3.2 单一元素及其组合添加对促生菌剂促生性能的影响
微生物在生长及其次级代谢过程中钙、镁、硼、锰、钼等起到极其重要的作用[15]，是各种酶的辅助因子及激活剂[16]；硼是固氮细菌固氮所必需的微量元素，在根瘤菌与宿主共生关系建立、表面多糖的形成以及根瘤菌侵染等过程中发挥着重要作用[17]；钼是固氮酶的组成因子，其在低浓度处理下可以提升甘蔗(Saccharum sinensis)体内的固氮菌的固氮酶活性[7]；锰可促进地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产表面活性物质[18]。本研究发现，当菌剂中分别添加100、100、5和10 mg·L−1的硼、钼、锰和镁时均可提升促生菌剂的固氮酶活性，其中100 mg·L−1的硼提升效果最显著，其次为镁和锰，而4种元素组合后无明显变化。其主要原因可能为：1)添加4种元素后可提升菌剂中固氮菌的数量，导致菌剂固氮能力增强。2)硼作为放线菌和根瘤菌固氮必须的微量元素，可能亦是本菌剂中固氮细菌固氮所必需的元素，适量的添加提升了本菌剂中固氮促生菌的固氮能力，因此其固氮能力有所提升且固氮效果最佳[19]。3)钼、镁、锰等作为生物酶的激活剂和前体，适量的添加可作为本菌剂中固氮酶的前体和激活剂，提升固氮酶活性[20]。此外，前人研究发现，过量的中、微量元素添加后不仅不会对微生物产生正向作用，反而会抑制微生物的生长和代谢[21]，在本研究中，当4种元素组合后，促生菌剂种含有的中、微量元素总量上升，可能产生了轻微抑制作用，导致菌剂中某一菌株的生长或代谢受到影响，因此处理组中的组合A2和A6添加至菌剂后，其固氮酶活性无明显变化。
相关研究表明，吲哚乙酸作为主要生长素参与植物许多生理过程，是植物生长发育的关键诱导因子[22]。刘璐等[23]研究发现，培养基中添加镁离子可显著提升产IAA菌产IAA的能力；贾西贝等[24]通过优化产IAA菌的培养条件发现，不同金属离子添加对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)分泌IAA的影响不同。本研究发现，锰和组合A6添加可提升菌剂分泌IAA能力，其原因可能是锰和组合A6添加后可促进菌剂中产IAA能力强的菌株数量增多[25]，导致菌剂分泌IAA增多，或锰和组合A6的添加可促进菌株合成色氨酸，后色氨酸经吲哚-3-乙酰胺或吲哚-3-丙酮酸途径合成吲哚乙酸，继而促进IAA合成[26]。
大量研究发现，外界环境如矿质营养、土壤微生物的相互抑菌作用、载体类型、土壤特性、溶磷菌与其他微生物间的交互作用、竞争能力以及在根际定殖能力等都会对溶磷菌的溶磷能力产生影响[27-28]。本研究中添加单一或组合中微量元素后，菌剂的溶磷能力各不相同，其中添加了硼、组合A5和A6的菌剂溶无机磷能力显著提升且pH降低，而添加了钼的菌剂溶无机磷能力被显著抑制且pH显著升高，其余两种单一元素和组合A2添加后无显著影响，其原因可能为添加硼、组合A5和A6后菌剂中有机酸和H+的含量升高，因此对难溶性无机磷的溶解能力增强[29]。有机磷溶解主要依靠酶解作用，某些溶磷微生物主要分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶，将有机磷转化为无机磷，为微生物和植物生长提供磷源[30]。本研究中添加单一中微量元素对菌剂的溶有机磷能力无显著影响，而补加不同元素的组合后菌剂溶有机磷的能力显著增强，其原因可能是元素组合添加后，几种元素互相作用可提升有机酸对磷酸钙中的Ca2+、Al3+等金属离子发生螯合作用，从而将磷酸钙中的PO43−释放出来[31]，或是几种元素组合添加后可促进菌剂中菌株对Ca2+的吸收能力增强，从而使溶磷能力增强，具体原因需进一步探究。
4. 结论
促生菌剂添加钼、硼、锰和镁分别为100、100、5和10 mg·L−1时，可提升菌剂的有效活菌数，且对菌剂的固氮酶活性、溶磷能力和分泌植物激素能力具有一定的促进作用。
4种元素进行正交组合后添加，组合A5 (钼、硼、锰、镁为100、150、5、5 mg·L−1)可提升菌剂的溶磷能力，组合A6 (钼、硼、锰、镁为100、50 、9 、10 mg·L−1)可提升菌剂分泌IAA能力和溶无机磷能力，两种组合均对菌剂固氮酶活性无显著影响。
综合分析结果表明，促生菌剂添加单一元素为5 mg·L−1锰最好；添加元素组合为A5 (钼100 mg·L−1、硼150 mg·L−1、锰5 mg·L−1、镁5 mg·L−1)最优。
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图 1 4种元素不同浓度添加对菌剂OD600的影响
A、B、C、D图分别为钼、硼、锰和镁元素添加量筛选。
Figure 1. Effects of the addition of four elements on the microbial inoculant OD600
Figure A, B, C and D show the content screening of elements Mo, B, Mn, and Mg, respectively.
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图 2 单一中、微量元素对促生菌剂有效活菌数的影响
CK表示未添加中微量元素；Mo代表钼元素；Mn代表锰元素；Mg代表镁元素；B代表硼元素，下图同。
Figure 2. Effects of single medium and trace elements on the effective viable number of microbial inoculants
CK indicates that no trace element is added; Mo stands for molybdenum; Mn stands for manganese; Mg stands for magnesium; B stands for boron. This is applicable for the following figure as well.
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图 3 不同元素及其组合对促生菌剂促生特性的影响
图中A2、A5、A6表示表4正交试验中的组合2、组合5、组合6。
Figure 3. Effects of different elements and their combinations on growth-promoting properties of microbial inoculants
A2, A5, and A6 in the figure represent combination 2, combination 5, and combination 6 shown in the orthogonal test in Table 4.
表 1 中、微量元素添加浓度梯度设置
Table 1 Medium and trace element mixture add concentration gradient setting
类型
Type名称
Name添加浓度
Concentration
gradient/(mg·L−1)微量元素
Trace element(NH4)6Mo7O24·4H2O 0, 20, 50, 100, 200 MnSO4·H2O 0, 5, 10, 20, 50 H3BO3 0, 10, 50, 100, 200 中量元素
Medium elementMgSO4·7H2O 0, 5, 10, 20, 50 
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表 2 正交试验设计
Table 2 Orthogonal experimental design
因素
Factor水平 Factor level −1 0 1 A: (NH4)6Mo7O24·4H2O 50 100 150 B: MnSO4·H2O 1 5 9 C: MgSO4·7H2O 5 10 15 D: H3BO3 50 100 150
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表 3 4种元素最适添加条件下对菌剂OD600的影响
Table 3 The influence of four elements on the microbial inoculant OD600 under optimal amendment conditions
时间
Time/h0 (CK) 100 mg·L−1 H3BO3 100 mg·L−1 (NH4)6Mo7O24 5 mg·L−1 MnSO4 10 mg·L−1 MgSO4 0 2.112 ± 0.004Fa 2.107 ± 0.004Fa 2.113 ± 0.006Fa 2.107 ± 0.005FGa 2.120 ± 0.005Ea 12 2.682 ± 0.003Abc 2.664 ± 0.008Ac 2.706 ± 0.009Aa 2.724 ± 0.006Aa 2.686 ± 0.001Ab 24 2.567 ± 0.004Ba 2.573 ± 0.025Ba 2.578 ± 0.010Ba 2.600 ± 0.023Ba 2.562 ± 0.002Ba 36 2.474 ± 0.001Cb 2.454 ± 0.004Cc 2.475 ± 0.010Cb 2.496 ± 0.001Ca 2.475 ± 0.001BCb 48 2.427 ± 0.008Cbc 2.406 ± 0.004CDc 2.442 ± 0.009CDab 2.468 ± 0.005Da 2.420 ± 0.012Cbc 60 2.366 ± 0.009Dab 2.352 ± 0.024Db 2.376 ± 0.006Dab 2.406 ± 0.013Da 2.381 ± 0.001Cab 72 2.241 ± 0.014Eb 2.244 ± 0.035Eb 2.244 ± 0.008Eb 2.317 ± 0.027Ea 2.248 ± 0.000Db 84 2.055 ± 0.009Gb 2.105 ± 0.046Fab 2.074 ± 0.005Fb 2.184 ± 0.043Fa 2.096 ± 0.014Eb 96 1.849 ± 0.030Hb 2.018 ± 0.034Ga 1.920 ± 0.047Gab 2.073 ± 0.043Ga 1.998 ± 0.082Fab 108 1.886 ± 0.370Hb 2.061 ± 0.413Ga 1.975 ± 0.569Gab 2.098 ± 0.040Ga 1.980 ± 0.057Fab 同列不同大写字母表示相同处理在不同时间差异显著(P < 0.05)，同行不同小写字母表示相同时间不同处理间差异显著(P < 0.05)；下表同。
Different capital letters within the same column indicate significant differences for the same treatment among different times at the 0.05 level, and different lowercase letters within the same row indicate significant differences for the same treatment among different times at the 0.05 level; This is applicable for the following tables as well.
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表 4 正交试验及极差分析结果
Table 4 Results of orthogonal test and range analysis
序号
Number(NH4)6Mo7O24
(A)MnSO4
(B)MgSO4
(C)H3BO3
(D)OD600 A1 1 −1 0 1 2.484 A2 1 0 1 −1 2.517 A3 1 1 −1 0 2.391 A4 0 −1 1 0 2.452 A5 0 0 −1 1 2.517 A6 0 1 0 −1 2.540 A7 −1 −1 −1 −1 2.497 A8 −1 0 0 0 2.514 A9 −1 1 1 1 2.508 K1 2.506 2.478 2.468 2.518 K2 2.503 2.516 2.513 2.452 K3 2.464 2.480 2.492 2.503 R2 0.042 0.032 0.045 0.066 主次顺序 Primary
and secondary orderD > C > A > B 最优水平
Optimal levelA−1B0C0D−1 Ki为各因素同一水平试验指标之和，i = 1, 2, 3；R为极差，计算方法是各因素Ki的最大值减去Ki的最小值；表中“0、−1、1”表示表2正交试验设计中水平编号。
Ki is the sum of test indexes at the same level of all factors, i = 1, 2, 3; R is the range, calculated by subtracting the minimum Ki value from the maximum Ki value of each factor; “0, −1, 1” in the table indicate the horizontal numbers in the orthogonal test design shown in Table 2.
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表 5 方差分析结果
Table 5 Results of variance analysis
项目
Item平方和(SS)
Sum of
squares自由度(df)
Degree of
freedom均方(MS)
Mean
squareF P A 0.010 2 0.005 10.342 *** B 0.008 2 0.004 8.637 *** C 0.009 2 0.004 9.252 *** D 0.021 2 0.011 22.090 *** Error 0.009 18 0.000 R2 = 0.848，调整后R2 = 0.781；***表示P < 0.01。
R2 = 0.848, adjusted R2 = 0.781; ***, P < 0.01.
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表 6 各处理的权重分析结果
Table 6 Weight analysis results of each process
项目
Item信息熵值e
Information entropy value e信息效用值d
Information utility value d权重
Weight/%无机磷含量 Inorganic phosphorus content 0.931 0.069 10.607 固氮酶活性 Nitrogen fixing enzyme activity 0.822 0.178 27.437 IAA 含量 IAA content 0.800 0.200 30.803 有机磷含量 Organic phosphorus content 0.798 0.202 31.153
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表 7 不同元素及其组合对促生菌剂促生特性影响的综合排名
Table 7 Comprehensive ranking of the effects of different elements and their combinations on the growth-promoting properties of microbial inoculants
处理
Treatment综合评价
Comprehensive evaluation排名
RankingCK 0.241 7 B 0.474 4 Mo 0.322 5 Mn 0.601 1 Mg 0.241 6 A2 0.126 8 A5 0.587 2 A6 0.511 3
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