遗传转化中使用的野生型拟南芥种子(Col-0型)由北京林业大学园林学院馈赠, 野生型拟南芥(WT)种子依次使用70%酒精和2%次氯酸钠溶液消毒并用灭菌水吸打冲净。所用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)菌株GV3101为寒区园林植物种质资源开发与景观生态修复黑龙江省重点实验室保存。胁迫抗性检测所用植物材料为转CBF1基因拟南芥T₃代种子。

植物表达载体pBI121-ClCBF1的构建参考徐春波等^[11]的方法。拟南芥生长至抽薹开花时, 即可采用农杆菌介导法进行遗传转化。使用含50 mg· L^-1卡那霉素的1/2MS培养基对T₀代种子进行抗性植株筛选。用Trizol法提取T₁代植株叶片总RNA并进行反转录, 以拟南芥ACT2基因(AT3G18780)为内参进行PCR, 对各株系中CBF1基因的转录情况进行检测。特异引物序列为:

CBF1-BamHI:TAGGATCCATGGACATGAACAA;

CBF1-SalI:GCGTCGACGTAACTCCATAACG.

1.3.1 转基因拟南芥种子萌发率和根长的测定 将WT和T₃代转基因拟南芥ClCBF1-3、ClCBF1-4、ClCBF1-5共3个株系种子4 ℃处理48 h, 消毒并播于含0、50、100、150、200 mmol· L^-1甘露醇的1/2MS培养基上, 以WT为对照, 观察、统计种子萌发率, 每个处理重复3次。7 d后把植株分别转移到相同胁迫梯度的1/2MS培养基中竖直培养, 观察并统计根长生长情况。

1.3.2 转基因拟南芥幼苗抗旱性测定 将WT和T₃代转基因拟南芥3个株系种子4 ℃处理48 h, 消毒, 播种于1/2MS培养基中, 20 d后植株长到4片真叶时, 将其移栽入蛭石∶ 营养土=1∶ 1的花盆中, 50 d后开始对其进行自然干旱处理, 胁迫15 d后取植株叶片测定生理指标, 每个指标取3株植株进行重复。成活率、相对电导率的测定参考曹忠慧^[12]的方法, 丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(POD)酶活性的测定参考李合生^[13]的方法。

1.4.1 转基因拟南芥种子萌发率及根长测定 盐胁迫下拟南芥种子萌发率和根长的测定试验方法同1.3.1, 1/2MS培养基中NaCl的浓度分别为0、50、100、150、200 mmol· L^-1。

1.4.2 转基因拟南芥幼苗耐盐性测定 拟南芥的培养过程及生理指标测定试验方法同1.3.2, 盐胁迫采用200 mmol· L^-1NaCl溶液浇灌15 d的方法。

使用SPSS 19.0和Excel 2007进行试验数据的计算和统计分析, 用Duncan法进行差异显著性分析。

通过花序浸染法转化拟南芥, 转基因拟南芥经过卡那霉素抗性筛选共得到5个株系(图1)。经过PCR检测, WT和转基因株系ClCBF1-2中没有检测出目的基因条带, 其余转基因植株与质粒PCR出的特异条带一致, 进一步证明目的基因已经在RNA水平表达。选取表达量较高的3个转基因株系ClCBF1-3、ClCBF1-4、ClCBF1-5进行干旱及盐胁迫耐性分析。

图1

Fig. 1

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	图1 转ClCBF1基因拟南芥T1代植株的RT-PCR鉴定 a:Col-0型拟南芥为阴性对照; b:含有目的基因的质粒为阳性对照; 1-5:T1代的5个株系。Fig. 1 RT-PCR of ClCBF1 fragments in T1transgenic Arabidopsis thaliana a:Negative control of untransgenic line; b:Positive control of plasmid; 1-5:Five transgenic lines of T1.

2.2.1 干旱胁迫对转基因拟南芥种子萌发率的影响 在没有添加甘露醇的1/2MS培养基中, WT和转基因种子的萌发率均为100%(图2)。随着甘露醇浓度逐渐升高, WT种子萌发率逐步显著下降, 转基因型萌发率在100和150 mmol· L^-1时略有下降, 随后在200 mmol· L^-1时明显降低, WT种子萌发率降至29.4%, 转基因拟南芥株系ClCBF1-3、ClCBF1-4、ClCBF1-5分别为65%、61%和62%, WT降低幅度大于转基因型; 通过观察可知, 在较高浓度甘露醇中, WT叶片较为细小, 颜色失绿发黄, 转基因型生长良好。由此可见, 转基因拟南芥种子在萌发阶段对干旱的抗性强于WT。

图2

Fig. 2

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图2 野生型植株(WT)与转基因拟南芥株系(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)种子萌发时期耐旱性及萌发率情况 不同字母表示相同甘露醇浓度不同基因型植株间差异显著(P< 0.05), 下同。Fig. 2 Drought tolerance and germination rate of transgenic Arabidopsis thaliana during (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5)germination Different lowercase letters indicate significant differences between different genotype plants in the same mannitol concentration at the 0.05 level; similarly for the following figures.

2.2.2 干旱胁迫对转基因拟南芥根长的影响 甘露醇浓度较低时, WT和转基因植株的根长均没有受到明显影响(图3), 100 mmol· L^-1时各株系根长有不同程度的降低, WT根长下降幅度最大且根长最短(P< 0.05), 随着甘露醇浓度的升高, 根长的增长被抑制, 植株叶片颜色加深, 甘露醇浓度在150、200 mmol· L^-1时, 转基因植株的根长大于WT(P< 0.05), 且须根显著多于WT。以上说明, 转入的CBF1基因提高了拟南芥对干旱胁迫的抵抗力。

图3

Fig. 3

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	图3 干旱胁迫对野生型植株(WT)和转基因拟南芥株系(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)根长的影响Fig. 3 The roots length of transgenic Arabidopsis thaliana treated (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5) with mannitol

2.2.3 干旱胁迫对转基因拟南芥表型及生理指标的影响 干旱胁迫15 d后, WT叶片黄化细小、部分干枯, 存活率为33.5%; 而转CBF1基因的拟南芥叶片黄化程度远低于WT(图4)。干旱处理拟南芥的生理指标如图5所示, 当植株未受到胁迫时WT和转基因拟南芥各酶活性基本持平, 植株受到干旱处理后转基因拟南芥酶活性显著大于WT植株(P< 0.05)。而WT和转基因植株未受到干旱胁迫时MDA和电导率差异不显著(P> 0.05), 在受到干旱胁迫后WT的MDA和电导率增大幅度大于转基因拟南芥(P< 0.05), 这说明转入的CBF1基因提高了拟南芥的抗旱性。

图4

Fig. 4

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	图4 干旱处理下转基因拟南芥表型情况Fig. 4 Phenotype of transgenic Arabidopsis thaliana under drought conditions

图5

Fig. 5

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	图5 干旱处理下野生型株系(WT)与转基因拟南芥(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)的POD、SOD、MDA、电导率相对含量Fig. 5 Contents of transgenic Arabidopsis thaliana under (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5) drought conditions

2.3.1 盐胁迫对转基因拟南芥种子萌发率的影响 当NaCl浓度为0和50 mmol· L^-1时, 各株系种子萌发率均为100%(图6)。随着NaCl浓度逐渐升高, WT和转基因型种子萌发率先略微降低, 然后大幅下降, 当NaCl浓度达到200 mmol· L^-1时, WT降至18%, 转基因分别降至16%、19%和21%。在较高浓度NaCl胁迫下, 拟南芥叶片短小、发黄略白, WT植株更为明显。由此可见, CBF1基因提高了拟南芥种子萌发期受到盐胁迫时的耐受性。

图6

Fig. 6

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	图6 野生型株系(WT)与转基因拟南芥(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)种子萌发时期耐盐性及萌发率情况Fig. 6 Salt tolerance and germination rate of transgenic Arabidopsis thaliana (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5) during germination

2.3.2 盐胁迫对转基因拟南芥根长的影响 NaCl浓度在0和50 mmol· L^-1时, WT和转基因植株的根长均在5.7 cm左右, 没有受到盐胁迫的明显影响(图7); 在NaCl浓度较高时各株系根长出现显著下降, WT下降幅度最大且根长最短, 转基因植株根长均显著高于WT(P< 0.05)。随着NaCl浓度的增加, 根部逐渐变得短而细小, 植株叶片细小发白出现死亡迹象, 这表明, 转入的CBF1基因提高了拟南芥根长生长过程的耐盐性。

图7

Fig. 7

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	图7 不同浓度NaCl处理下野生型株系(WT)与转基因拟南芥(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)根长情况Fig. 7 Rootlengths of transgenic Arabidopsis thaliana (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5) treated with NaCl

2.3.3 盐胁迫对转基因拟南芥表型及生理指标的影响 NaCl溶液浇灌处理后, WT大部分叶片发黄失绿、甚至干枯死亡; 而转CBF1基因拟南芥少部分叶尖黄化, 大部分生长正常(图8)。未胁迫时WT和转基因拟南芥MDA含量、相对电导率和酶活性均差异不显著(P> 0.05), 在盐胁迫下, 转CBF1基因拟南芥各株系酶活性均显著高于WT(P< 0.05), WT的MDA含量和电导率显著高于转基因拟南芥(图9), 说明WT由于受到了盐胁迫而积累了大量MDA。综上, CBF1基因提高了拟南芥对于盐胁迫的耐受能力。

图8

Fig. 8

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	图8 盐处理转基因拟南芥表型情况Fig. 8 Phenotype of transgenic Arabidopsis thaliana treated with NaCl

图9

Fig. 9

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	图9 不同浓度NaCl处理下野生型株系(WT)与转基因拟南芥(CBF1-3、CBF1-4、CBF1-5)POD、SOD、MDA、电导率相对含量Fig. 9 Contents of transgenic Arabidopsis thaliana (CBF1-3, CBF1-4, CBF1-5) treated with NaCl