本研究以中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供的20个不同品种的紫花苜蓿为父本, 吉林省农业科学院提供的MS-GN为母本构建的杂交组合, 随机选择性状优良的父本10-7481、05-1215、11-8540、11-8502、05-11535的5个杂交组合为研究材料, 并分别编号Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ 进行冻害胁迫。试验地处吉林省长春市吉林农业大学, 于2017年5月24日将营养土灭菌, 每个育苗器内播种6粒种子, 每个杂交组合各种3份, 做好标记后移至HPG-400HX人工气候箱培养(光照12 000 lx, 15 h, 温度25 ℃, 湿度75%; 无光照, 9 h, 温度20 ℃, 湿度75%), 2周后, 再移到实验室阳光充足的地方室温培养2周; 将苗期苜蓿连同育苗器移栽至盛有相同营养土的花盆中, 花盆高15 cm、口径10 cm, 做好标记, 培养30 d。

2017年7月24日开始进行抗寒锻炼:20 ℃/15 ℃(15 h/9 h)、15 ℃/10 ℃(15 h/9 h)、10 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、5 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、0 ℃/0 ℃(15 h/9 h); 冷冻阶段:-15 ℃/-20 ℃(15 h/9 h); 返青阶段:5/5 ℃解冻后, 10 ℃/5 ℃(15 h/9 h)、15 ℃/10 ℃(15 h/9 h)、20 ℃/15 ℃(15 h/9 h)、25 ℃/20 ℃(15 h/9 h, 培养7 d)观察返青数。同时以25 ℃/10 ℃(15 h/9 h)作为对照组; 各阶段最后一天取样测定脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)。

本研究所采用的试剂盒统一购买于南京建成生物工程研究所。

1.2.1 植物组织液的提取 称取0.150 0 g幼苗的新鲜叶片剪碎, 加入0.05 mol· L^-1、pH 7.8的磷酸缓冲液1.5 mL及少量的石英砂于研钵中研磨, 移至2 mL离心管中, 5 000 r· min^-1、4 ℃下离心10 min, 取上清液, 用于指标测定。

1.2.2 SOD活性的测定 采用抽提法测定SOD活性^[7]。

1.2.3 MDA含量的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法^[7], 使用试剂盒, 测定532 nm下的OD值。

1.2.4 SS含量的测定 采用蒽酮比色法测定植物可溶性糖含量, 在620 nm下比色, 测定吸光度值^[7]。

1.2.5 SP含量的测定 采用考马斯亮蓝G-250染色法测定, 首先, 用牛血清蛋白制作标准曲线; 其次, 吸取组织液0.2 mL, 加入2 mL考马斯亮蓝G-250试剂, 充分混匀, 静置5 min后, 在595 nm的波长下测定OD值, 通过制作的标准曲线计算蛋白质含量。

1.2.6 Pro含量的测定 采用酸性茚三酮法测定Pro含量^[7]。

采用Fuzzy数学中隶属函数法进行综合评判^{[8, 9, 10]}。

与抗寒性呈正相关的参数SP、SS、SOD、Pro采用公式:

U(X_ijk)= Xijk-XminXmax-Xmin; (1)

与抗寒性呈负相关的参数MDA采用公式:

U(X_ijk)=1- Xijk-XminXmax-Xmin。 (2)

式中:X_ijk表示第i个品种第j个处理下的第k个指标的测定值; U(X_ijk)表示第i个品种第j个处理下的第k个指标的隶属度, 且U(X_ijk)∈ [0, 1]; X_min、X_max表示测定值中的最小值和最大值。

试验所得数据均采用Excel作图, SPSS 18.0统计软件分析。

经过低温胁迫, 植物解冻恢复生长7 d后的返青苗数除以每个杂交组合的总苗数(18株), 即为返青率, 各杂交组合返青情况为Ⅴ > Ⅲ > Ⅰ > Ⅱ > Ⅳ 。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 各杂交组合返青情况 Table 1 The rate of turning green of alfalfa hybrid combination 编号 Code 杂交组合 Hybrid combination♀× ♂ 出苗数/株 Number of seedling/plant 返青率 Rate of turning green/% Ⅰ MS-GN× 10-7481 12 67 Ⅱ MS-GN× 05-1215 10 56 Ⅲ MS-GN× 11-8540 14 78 Ⅳ MS-GN× 11-8502 8 44 Ⅴ MS-GN× 05-11535 16 89

表1 各杂交组合返青情况 Table 1 The rate of turning green of alfalfa hybrid combination

供试材料可溶性蛋白含量总体趋势是升高的(图1), 在返青阶段, 外界温度回升时可溶性蛋白含量显著高于其他阶段(P< 0.05), 达到最大值, 分别为1.591、1.593、1.592、1.595和1.594 mg· g^-1。Ⅱ 号杂交组合在冷冻阶段可溶性蛋白含量为1.459 mg· g^-1, 较抗寒锻炼阶段的1.464 mg· g^-1有所降低, 且降幅显著(P< 0.05), 但与对照组1.268 mg· g^-1相比显著增长(P< 0.05), 其余杂交组合各阶段的可溶性蛋白含量与对照相比均显著增长(P< 0.05)。

图1

Fig. 1

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	图1 冻害胁迫对供试材料可溶性蛋白含量的影响 不同字母表示不同处理间差异显著 (P< 0.05)。Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ , Ⅴ 同表1, 下同。Fig. 1 Effect of freezing injury on the soluble protein content of alfalfa Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level; Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ , Ⅳ , Ⅴ are the same as Table 1; similarly for the following figures.

不同杂交组合SOD的活性总体呈现先升高后降低的趋势(图2)。Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅴ 号杂交组合在冷冻阶段的SOD活性显著高于其他各阶段, 达到最大值分别为22.201、22.907、22.986和21.989 U· (mg· min)^-1; 返青阶段SOD活性分别为17.411、16.488、16.414和15.893 U· (mg· min)^-1均显著低于冷冻阶段(P< 0.05)。Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ 号杂交组合返青阶段SOD活性分别为:17.411、16.488、16.414和18.242 U· (mg· min)^-1均显著低于抗寒锻炼, 抗寒阶段分别为21.658、22.317、19.676和21.138 U· (mg· min)^-1。Ⅴ 号杂交组合对照组SOD活性为10.365 U· (mg· min)^-1显著低于其他3组的SOD活性(P< 0.05)。

图2

Fig. 2

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	图2 低温胁迫下对供试材料超氧化物歧化酶活性的影响Fig. 2 Effect of freezing injury on the SOD activities of alfalfa

不同杂交组合在经过冻害胁迫后, 植物体内可溶性糖的含量总体呈现先降低后升高再降低的趋势(图3)。每个杂交组合抗寒锻炼阶段的可溶性糖含量均最小, 显著低于其他各阶段(P< 0.05), 分别为1.643、3.314、2.680、0.580和5.040 mg· g^-1; 冷冻阶段的含量显著高于对照组及其他各阶段(P< 0.05), 达到最大值为6.828、6.807、7.387、5.706和6.140 mg· g^-1; 返青阶段的含量分别为4.847、6.060、5.354、5.325和5.257 mg· g^-1 显著高于对照组的4.524、4.878、3.893、2.220和5.142 mg· g^-1(P< 0.05), 且显著低于冷冻阶段(P< 0.05)。

图3

Fig. 3

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	图3 冻害胁迫下对供试材料可溶性糖含量的影响Fig. 3 Effect of freezing injury on the soluble sugar content of alfalfa

各杂交组合植株体内脯氨酸的含量变化总体表现为升高的趋势(图4)。Ⅰ 号杂交组合冷冻阶段脯氨酸含量40.483 μ g· g^-1显著高于其他各阶段(P< 0.05), 且返青阶段脯氨酸含量35.222 μ g· g^-1显著高于对照组15.334 μ g· g^-1及抗寒锻炼阶段19.760 μ g· g^-1(P< 0.05); Ⅱ 号杂交组合抗寒锻炼阶段脯氨酸含量为35.479 μ g· g^-1略低于对照组35.672 μ g· g^-1 (P> 0.05), 并且显著低于冷冻阶段39.072 μ g· g^-1及返青阶段58.447 μ g· g^-1(P< 0.05), 返青阶段显著高于其他各组(P< 0.05), 达到最大值58.447 μ g· g^-1; Ⅳ 号杂交组合冷冻阶段脯氨酸含量显著高于其他阶段(P< 0.05), 达到最大值53.956 μ g· g^-1, 抗寒锻炼阶段脯氨酸含量32.977 μ g· g^-1略低于对照组33.811 μ g· g^-1(P> 0.05)。Ⅲ 、Ⅴ 号杂交组合脯氨酸含量随着温度的改变而逐步升高, 返青期最高。

图4

Fig. 4

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	图4 冻害胁迫下对供试材料脯氨酸含量的影响Fig. 4 Effect of freezing injury on the proline content of alfalfa

各杂交组合体内MDA含量总体呈增加的趋势(图5)。各杂交组合返青阶段MDA含量显著高于其他各阶段(P< 0.05), 分别为0.607、0.586、0.506、0.620和0.665 nmol· g^-1。抗寒锻炼阶段Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅴ 的杂交组合丙二醛含量为0.290、0.160和0.413 nmol· g^-1, 低于对照组, 对照组含量0.300、0.181和0.422 nmol· g^-1, 但降幅不显著(P> 0.05)。各杂交组合冷冻阶段MDA含量0.395、0.500、0.432、0.454和0.509 nmol· g^-1, 返青阶段MDA含量0.607、0.586、0.506、0.6201和0.665 nmol· g^-1均显著高于对照组, 对照组MDA含量0.142、0.300、0.181、0.111和0.422 nmol· g^-1(P< 0.05)。

图5

Fig.5

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	图5 冻害胁迫下对供试材料丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of freezing injury on the MDA content of alfalfa

本研究利用Fuzzy数学中的隶属函数法, 求得各项指标的隶属函数值, 对5个杂交组合抗寒性进行综合评价, 结果表明, 抗寒性由强至弱的杂交组合依次是Ⅴ > Ⅲ > Ⅰ > Ⅱ > Ⅳ 。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 各杂交组合抗寒性综合评价 Table 2 Subordinate evaluation of cold resistance character of hybrid combination 杂交组合编号 Hybrid combination code 可溶性蛋白 Soluble protein 超氧化物歧化酶 SOD 可溶性糖 Soluble sugar 脯氨酸 Pro 丙乙醛 MDA 均值 Average Ⅰ 0.525 0.385 0.543 0.492 0.496 0.488 Ⅱ 0.547 0.458 0.558 0.291 0.564 0.484 Ⅲ 0.609 0.451 0.456 0.469 0.538 0.505 Ⅳ 0.641 0.355 0.561 0.339 0.418 0.463 Ⅴ 0.597 0.540 0.323 0.667 0.645 0.554

表2 各杂交组合抗寒性综合评价 Table 2 Subordinate evaluation of cold resistance character of hybrid combination