2000年以来, 我国石油对外依存度逐年上升^[5]。木质纤维素作为世界上储量最大的可再生能源^[6], 在厌氧发酵方面有巨大潜力^[7]。木质纤维素是草坪草的重要组成成分之一^[8], 约占其干物质质量的60%。在用干稻(Oryza sativa)秸、草坪草、新鲜玉米(Zea mays)秸、风干玉米秸在牛粪液中进行酸化发酵的试验中, 草坪草质量减少最快且减少最多, 质量减少率达73.25%, 其木质纤维素降解效率也高于新鲜玉米秸和风干玉米秸, 仅次于稻秸。且在酸化过程中, 草坪草可实现溶解性化学需氧量(soluble chemical oxygen demand, SCOD)的积累, 其SCOD在第6天达5 240 mg· L^-1, 因此其比干、鲜玉米秸更适合厌氧发酵^[9]。

相较于农作物秸秆, 草坪草具有质地柔软^[10]、直径小、易酶解^[11]、粉碎耗能小等优点, 其可发酵糖含量也约等同于小麦(Triticum aestivum)秸秆^[12]。通过粉碎和用固液比(质量比)为1∶ 40碱性氧化物浸泡等物理方法, 对收割后的枯黄草坪草进行预处理发现, 木质素脱除率可达70%(质量分数); 用果胶酶和纤维素酶混合糖化纤维素, 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)发酵水解液生产乙醇, 发酵30 h后乙醇质量体积分数最高, 可达11.7和9.6 g· L^-1, 糖醇转化率分别为38.1%和25.7%(质量分数), 分别是理论糖醇转化率的74.7%和61.2%^[13], 可见用草坪草屑生产乙醇潜力巨大。

草坪草屑还可发酵生产甲烷。对早熟禾(Poa annua)、白三叶(Trifolium repens)和聚合草(Symphytum officinale)废料进行厌氧发酵试验发现, 白三叶虽产气快, 但是产气时间短, 累计产气量最少; 早熟禾产气量最高, 分别是白三叶和聚合草的4.3倍和1.9倍。从发酵第8天到第40天结束, 早熟禾、白三叶和聚合草的平均甲烷含量分别可达59.8%、45.8%和59.9%^[14]。将草坪草屑和污泥混合发酵发现, 草屑和污泥比例为1∶ 2时, 产气量最大, 达348 L· kg^-1, 比污泥单独发酵产气量高30%^[15]。用33%的落叶混合66%的草坪草屑, 发酵产气量为325 L·kg-116。对草坪草(种未知)进行产气处理, 可一定程度减轻我国能源不足的问题。Berndt等^[11]还使用纤维素酶对狗牙根(Cynodon dactylon)草屑进行处理, 发现纤维素酶短期内可以加快草屑的分解及对酶的合理运用, 或许可以在产业化生产中起到关键的作用。

综合而言, 以早熟禾为代表的禾本科草坪草比以白三叶为代表的豆科草坪草更具产气潜力, 白三叶产酸快且量大, 不易被甲烷菌转化利用, 更适合作为发酵中的pH调节剂使用, 鉴于豆科草坪草本身具有较高的蛋白质含量, 对其进行饲料化利用和深加工是更好的选择。对草坪草屑的能源化利用还处于探索阶段, 现阶段最多用于生态校园建设等小规模利用, 若要产业化生产乙醇或甲烷, 仍需考虑收集、运输等成本问题。

草坪修剪后, 可直接将草屑晾晒后还坪, 一方面可以增加土壤肥力, 降低土壤酸性, 另一方面还能对草坪起到遮阴保湿作用。Waddill^[27]发现将草坪草屑直接铺在草地上, 可以使草坪颜色加深且生长更茂盛, 草屑渗入土壤后可以释放包括氮素在内的大量营养物质。直接还坪虽然方便, 但是对土地肥力的增加和土壤的改良效果有限。将草坪草屑堆肥后作为土壤改良基质是一种更好的选择, 不仅能增加土壤孔隙度, 改善土壤结构, 提高土壤渗透性^[28], 对生态系统碳素^[29]和氮素^[30]的循环也有重要意义。

堆肥是利用自然界微生物对有机物有控制的进行生物降解, 使之转化为腐殖质的生物处理技术^[31]。相较于木质素较高的枯枝落叶, 木质素含量较低的草坪草屑腐熟速度更快, 且堆体升温速度快, 在第3天堆体温度便能达到80 ℃, 高温维持时间更长, 能维持19 d, 堆腐后期堆体pH上升至8~9, 符合腐熟标准。研究发现, 草坪草屑虽然细菌多样性小于枯枝落叶, 但是细菌生物量并不比枯枝落叶中少, 且堆腐前期更高^[32]。通过堆肥, 还可以有效分解草屑中的杀虫剂、除菌剂等毒性试剂^[33]。

在污泥中直接加入草坪草屑后, 有机质分解率可由8.1%提高到36%^[34], 热量平衡计算表明草屑在发酵过程中可以有效调理堆料的C/N, 同时为微生物提供初期碳源, 既能作调理剂和起爆剂, 又能为高温菌提供营养, 草屑堆肥C/N适合范围为20~30, 最佳C/N为25^[35], 引入外源微生物后比单纯草屑堆肥效果好。

对草坪草屑进行适当处理, 可加强堆肥效果。对草坪草进行湿解处理后, 有机质转化率逐渐增加, 具有相当高的腐熟度, 当反应强度大于4.05时, 腐殖化率大于1.0^[36]。将草屑粉碎处理后再堆肥, 可以加大与微生物的接触面积, 从而将分解速率加快两倍以上^[37]。在草坪草屑中加入EM复合菌剂有助于堆肥加速进入高温分解阶段, 2 d便可升温至60 ℃以上, 同时延长高温分解时间, 缩短发酵堆肥时间, 降低C/N, 加速草坪草屑堆肥腐熟进程, 加大堆肥中氮的增长幅度, 提高堆肥的产品品质^[38]。时佩等^[39]将高尔夫球场草屑和有机肥(鸡粪)按照不同比例混合后加入菌剂发酵, 确定有机肥加入量以20%为宜, 21 d后发酵成熟, 发酵产物pH适中, 使用安全, 养分含量丰富, 与沙土混合构成的基质能显著提高草坪质量。Ro^[40]将草坪草屑和糖蜜、微生物相混合, 制得液体肥料, 1 g草混合2.4~3.6 mL糖和1.6~2.4 mL有效微生物, 发酵15 d, 同样取得良好效果。

不同草坪草应因地制宜, 可以选择简易堆肥或者采用堆肥池、露天条垛堆肥、堆肥箱等堆肥装置, 对草屑做到最大限度的利用。另一方面, 将草屑堆肥作为土壤改良基质, 虽然可以改善土壤结构, 增加土壤孔隙度, 但如果加入过量, 则会使土壤孔隙过大导致水分流失, 因此使用时还需注意用量。由于目前堆肥多为小规模试验, 实际应用时也需核算减少的化肥、农药用量, 考虑投入和产出比, 以便为草坪管理者提供科学合理的决策依据。

高质量蛋白质来源匮乏, 人类做了很多努力来寻找新的蛋白质来源, 如昆虫、藻类, 还有叶蛋白^[41]。叶蛋白(leaf protein concentration, LPC)是将新鲜植物茎叶压榨取汁, 将汁液中蛋白质分离、干燥得到的高质量浓缩物^[42], 是世界上最大的蛋白质来源^[43]。植物叶片中蛋白质占其干物质的10%~20%^[44], 叶蛋白营养全面, 含多种活性因子, 具有一定的保健作用^[45]。从草坪草屑中提取叶蛋白, 是对草屑的一种有效的利用方法。

草屑叶蛋白提取工艺受多因素影响, 若以白三叶草为原料, 用水作为提取剂, 采用絮凝法和盐析法相结合的方法来提取三叶草可溶性蛋白, 考察加盐量、料液比、絮凝温度和提取液pH值对蛋白质提取率的影响, 得到的最佳工艺组合条件为料液比1∶ 30, 温度70 ℃, 时间10 min, pH值3.0, 加盐量3%, 此条件下蛋白提取率达16.05 mg· g-146。不同种的草坪草, 所得最佳提取工艺也有所差别。陈浪等^[47]以相同的4个影响因素设计正交试验, 以蛋白提取率和蛋白质量分数为评价指标, 得到草坪草叶蛋白的最优提取工艺组合的料水比为1∶ 30, 但pH值为3.5、加盐量1.2%、絮凝温度为60 ℃。叶蛋白提取后, 可以对叶蛋白粗成品进行纯化, 使用酸化加热法对白三叶叶蛋白纯化工艺进行研究, 通过正交试验发现对叶蛋白的提取各因素影响大小为pH> 温度> 时间> 料液比, 最佳提取工艺则为pH值4.0、温度80 ℃、加热时间9 min、料液比1∶ 2。对叶蛋白纯化结果则表明, 纯化剂对叶蛋白的纯度的影响大小依次为甲醇> 乙醇> 丙酮> 四氯化碳> 水^[48]。在众多叶蛋白沉淀试验中, 加酸和加热仍是使用最为普遍的方法。

事实上, 提取工艺的选择, 对蛋白提取率的大小有着至关重要的影响^[49]。惠文森和王康英^[50]使用不同的方法提取草坪草叶蛋白, 发现叶蛋白提取率从高到低表现为絮凝剂加热法> 直接加热法> 絮凝剂法, 另有研究得出叶蛋白提取率从高到低表现为加酸加热法> 直接加热法> 酸提法^[51], 邹文辉等^[52]通过试验同样发现酸化加热法> 直接加热法> 碱化加热法> 酸提法> 碱提法。不同方法的优缺点及对应草坪草屑叶蛋白提取率如表2所示。

由于叶蛋白的传统提取方法提取率及纯度均较低, Xu等^[53]还利用双向凝胶电泳(2-DE)提取草坪草地上部叶蛋白, 发现用TCA/丙酮法分离叶蛋白较有效, 达15.22 mg· g^-1(鲜样), 远高于Chloroform法的7.32 mg· g^-1 、Phenol法的6.64 mg· g^-1和Tris-base法的7.15 mg· g^-1。

草坪草屑提取叶蛋白最大的限制因素是其本身的蛋白含量较低, 易造成提取成本高而获得叶蛋白却很少的现象。目前草坪仍主要使用禾本科草种, 其蛋白含量远低于以白三叶为代表的豆科草坪草, 因此将来对禾本科草坪草的应用应集中于能源化利用, 而对豆科草坪草应进行叶蛋白提取等深加工处理。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 草坪草屑叶蛋白提取方法 Table 2 Extraction of leaf protein from turfgrass 提取方法 Extraction method 优点 Advantage 缺点 Disadvantage 蛋白质提取率 Ratio of protein extraction/% 直接加热法 Direct heating 成本低, 适合大规模制备; 蛋白质迅速凝集, 蛋白质酶解作用停止, 可减少蛋白损失; 叶蛋白结构紧密, 易于收集; 终止脱镁叶绿素的形成, 避免动物食用后产生过敏反应 low cost, suitable for large-scale preparation; rapid protein agglutination, protein cessation stop, which can reduce loss of protein; leaf protein structure is tight, easy to collect; termination of pheophytin formation, to avoid the animals after eating allergic reactions 破坏蛋白活性 destruction of protein activity 2.0~2.7 酸化加热法 Acidification heating 成本低, 适合大规模制备; 蛋白聚集快, 蛋白质酶解作用停止, 可减少蛋白损失; 抑制加工过程中的微生物生长 low cost, suitable for large-scale preparation; rapid protein agglutination, protein cessation stop, which can reduce loss of protein; inhibition of microbial growth during processing 胡萝卜素和不饱和脂肪酸损失加大; 叶蛋白纯度较低; 叶蛋白颜色发黄, 气味不芬芳 carotene and unsaturated fatty acid loss increased; leaf protein purity is low; colour of leaf protein is yellow and smell is bad 3.1 碱化加热法 Alkalization heating 叶蛋白起泡性、持水性、吸油性较好; 破坏多种不利因子, 如某些酶类、植物雌激素及皂素等; 叶黄素稳定性提高 leaf protein foaming, water retention, oil absorption is better; damage a variety of adverse factors, such as certain enzymes, phytoestrogens and saponins; lutein stability improved 胡萝卜素和不饱和脂肪酸损失加大; 叶蛋白颜色发黑, 结构疏松, 品质较差 carotene and unsaturated fatty acid loss increased; leaf protein purity is low; colour of leaf protein is black and structure is friable 2.6 酸提法 Acidification 操作简单; 酸性等电点可使叶蛋白凝聚, 充分沉降; 可减少生物碱含量 simple operation; acidic isoelectric point can make leaf protein aggregate and fully settled; reduce the alkaloid content 强酸会使蛋白质变性; 耗酸量大; 叶蛋白结构疏松; 加速了不饱和脂肪酸的氧化, 使胡萝卜素的损失增多 strong acid will cause protein denaturation; consumption of acid; structure of leaf protein is friable; accelerate the oxidation of unsaturated fatty acids and carotene lose more 1.9~2.5 碱提法 Alkalization 操作简单, 碱性等电点可使叶蛋白凝聚, 充分沉降; 可破坏多种不利因子, 如某些酶类、植物雌激素及皂素等 simple operation, basic isoelectric point can make leaf protein aggregate and fully settled; damage a variety of adverse factors, such as certain enzymes, phytoestrogens and saponins, etc. 强碱会使蛋白质变性; 耗碱量大; 叶蛋白结构疏松 strong alkali will cause protein denaturation; consumption of alkali; structure of leaf protein is friable 1.7

表2 草坪草屑叶蛋白提取方法 Table 2 Extraction of leaf protein from turfgrass

膳食纤维包含纤维素、半纤维素和木质素等非淀粉多糖物质, 在预防现代一些慢性病方面有显著作用^[54]。叶蛋白提取后的草坪草渣, 也可用于提取膳食纤维^[55]。王文君等^[56]采用正交试验, 用新鲜白三叶提取膳食纤维, 发现最佳提取条件为:温度60 ℃, 料液比15 mL· g^-1, pH 6.5, 提取时间120 min, 提取率为3.65%。

叶绿素是一种天然色素, 既可作为食品添加剂, 也可作为化妆品或医药用品的着色剂, 并起到一定的医疗保健作用, 从草坪草屑中提取的天然叶绿素比合成的色素更加健康。用乙醇提取三叶草叶绿素, 得到最佳工艺为料液比1∶ 15, 提取温度60 ℃, 提取时间1.5 h^[57]。用丙酮提取三叶草叶绿素, 得到最佳工艺为料液比1∶ 15, 提取温度55 ℃, 提取时间4 h^[58]。由于叶绿素耐光、耐热、耐酸碱能力较差, 应用范围会受到限制, 故还可对其天然结构进行修饰增强其稳定性, 如以狗牙根和结缕草(Zoysia japonica)为原料, 常温提取叶绿素, 合并皂化与收醇工序, 使用45 ℃低温铜代和反萃结晶提纯技术来制取叶绿素铜钠, 最终得率为0.5%^[59]。