本研究使用的玉米转化受体为Hi-Ⅱ 品种, 转育用亲本自交系为郑 58(Z58)和昌7-2, 种子由浙江大学转基因抗虫植物和生物安全实验室保存并种植, 对照组郑单958是Z58和昌7-2杂交获得的杂交种。转化事件AG16 T₀代与Z58杂交后, 以Z58为轮回亲本, 回交4代, 再自交2代, 得到含有草甘膦抗性基因的自交系Z58-AG16, Z58-AG16与昌7-2杂交获得的F₁代杂交种用于本研究。

采用PCR扩增方法检测转基因玉米AG16目的基因。采集5个Z58-AG16与昌7-2杂交获得的F₁代玉米叶片, CTAB法^[24]提取玉米基因组, 用NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)检测所提取玉米基因组的质量和浓度。根据目的基因设计引物G10evo-F(GACGCCCTGCCCGCCACCTTC)和G10evo-R(GGCGGTGGCCTCAGCGTACTCG), 扩增产物用含有1% EB的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果, 用凝胶成像系统观察结果并拍照。

Southern blot^[25]分析使用Roche的DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅱ 试剂盒(Roche, Basel, Switzerland)。CTAB法提取玉米基因组, 选择适当的两种酶分别酶切100 μ g玉米基因组, 酶切片段用0.8%的琼脂糖凝胶分离, 分离后转带正电的尼龙膜(Amersham, UK), 转膜20 h左右。利用PCR方法扩增合成杂交探针, 扩增的目的片段使用DIG-High Prime DNA Labeling标记。转膜结束后120 ℃烘烤尼龙膜, 30 min后, 将尼龙膜置于杂交管中, 42 ℃预杂交30 min, 倾尽预杂交液, 加入含地高辛标记探针的杂交液, 55 ℃杂交过夜。最后洗膜, 化学曝光显影20 min。

采用Western blot^[26]的方法来检测转基因玉米AG16的G10evo蛋白表达情况。采集玉米新鲜叶片0.1 g, 液氮浸泡, 研磨。磨碎的粉末中加入200 μ L PBS, 混匀离心, 取上清, 按体积比加入5× SDS-PAGE Loading Buffer。制备好的蛋白样品用SDS-PAGE电泳分离, 分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上, 再将膜封闭在含5%的脱脂奶粉的TBST溶液中, 37 ℃摇床1 h。封闭完成后, 换1%的脱脂奶粉的TBST溶液, 向溶液中按1∶ 2 500的比例加入一抗, 37 ℃摇床孵育1 h, 再用TBST洗膜3次, 每次5 min。一抗孵育后在1%的脱脂奶粉的TBST溶液中, 按一定比例加入二抗, 37 ℃摇床孵育1 h。最后洗膜, DAB显色, 显色至出现条带时用水清洗膜, 晾干, 拍照。

在温室种植转基因玉米AG16和非转基因玉米郑单958采用盆栽的方式, 盆的大小为直径(d)30 cm× 高(H)50 cm, 每盆4株, 后期间苗, 每盆保留两株。每盆做好标签, 等到玉米生长到4-5叶期的时候, 分别对其喷施不同浓度的草甘膦, 每个浓度4个重复, 一周后拍照记录。本研究喷洒的草甘膦为美国孟山都公司生产的农达(20150425, Monsanto, LaConner, USA), 是灭生性内吸传导型茎叶除草剂, 通过植物绿色部位吸收。原产地马来西亚, 水剂型, 有效成分含量30%, 草甘膦异丙胺盐含量41%, 玉米田间推荐使用药量为每亩150~250 mL, 每亩合(666.67 m²)兑水30~40 L, 约2.05 g· L^-1, 45 mL· m^-2。将水剂农达用水按体积比稀释成有效质量浓度为0、2.05 (1∶ 200)、4.10 (1∶ 100), 8.20 (1∶ 50)和16.40 g· L^-1 (1∶ 25)共5个梯度, 分别喷洒在转基因玉米和非转基因玉米上, 每盆样品的喷洒量为45 mL· m-217。

用ELISA试剂盒(YouLong Biotech, Shanghai)检测转基因玉米不同组织的G10evo蛋白表达情况。操作方法参考G10-EPSPS试剂盒使用手册。从转基因玉米AG16和非转基因玉米郑单958提取根、茎和叶片中的蛋白, 叶片从新叶到老叶取4片叶片(Leaf 1, Leaf 2, Leaf 3, Leaf 4)分别提取蛋白, 每个组织6个重复, 在450 nm下测其吸光度^[26]。

任意采集5株转基因玉米植株AG16和1株非转基因郑单958的叶片, 用于PCR鉴定。用CTAB法提取转基因玉米和非转基因玉米基因组, 对载体1300-p35S-pUbi-G10evo(图1)中的T-DNA中的目的基因G10evo进行鉴定, 确定是否含有T-DNA。预计扩增G10evo基因目的条带大小为1 311 bp, 用含有 1% EB的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。结果显示, 5株AG16转基因玉米基因组中扩增出G10evo基因的目的片段均为1 300 bp左右, 与阳性质粒扩增出的条带大小一致, 非转基因对照组没有出现条带, 这说明5个F₁代杂交后代中均含有G10evo基因(图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 载体1300-p35S-pUbi-G10evo图谱Fig. 1 Map of the vector 1300-p35S-pUbi-G10evo

图2

Fig. 2

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	图2 转基因玉米G10evo PCR鉴定 注:M, 基因Marker; +, 阳性质粒对照; -, 非转基因玉米对照; 1-5, 转基因玉米随机挑选的植株。Fig. 2 PCR analysis of G10evo in GM-maize Note: M, DNA maker (Tran2K plus, Transgen); +, Positive plasmid(CK); -, Non-GM-maize (CK); 1-5, Different GM-maize plants.

用草甘膦筛选过的转基因阳性玉米, 进行DNA印记检测(Southern blot), 以检测T-DNA的拷贝数。根据G10evo基因序列设计合成探针的引物G10evo-PRB-F(GACGCCCTGCCCGCCACCTTC)和G10evo-PRB-R(GGCGGTGGCCTCAGCGTACTCG)。AG16基因组和玉米阴性对照分别用KpnⅠ 和EcoRⅤ 单酶切, 阳性质粒用KpnⅠ 单酶切, 杂交温度根据GC含量设定为55.5 ℃。阳性质粒酶切片段大小4 536 bp, EcoRⅤ 的酶切片段大小为5 000 bp左右, KpnⅠ 的酶切片段大小为7 400 bp左右, 均符合预期的大小。而且AG16的两种酶切片段的Southern blot结果显示G10evo在玉米基因组中为单拷贝(图3)。

图3

转基因玉米AG16中G10evo的Southern blot分析
注:+, 阳性质粒KpnⅠ 酶切; 1, AG16基因组EcoRⅤ 酶切; 2, 非转基因玉米基因组EcoRⅤ 酶切; 3, AG16基因组KpnⅠ 酶切; 4, 非转基因玉米基因组KpnⅠ 酶切。

Southern blot of G10evo in AG16
Note: +, KpnⅠ digest Positive plasmid; 1, EcoRⅤ digest AG16 genome; 2, EcoRⅤ digest Non-GM Maize genome; 3, KpnⅠ digest AG16 genome; 4, KpnⅠ digest Non-GM Maize genome.

用Western blot方法对抗草甘膦玉米转化系AG16不同组织G10evo蛋白的表达分析结果显示, 抗草甘膦蛋白G10evo在根、茎和叶等组织中均有表达, 目的蛋白分子与原核表达的G10evo大小一致, 为48 kDa, 且叶片和茎中G10evo的表达量明显高于根部(图4)。

图4

Fig. 4

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	图4 Western blot分析检测转基因玉米G10evo蛋白表达 注:M, 预染蛋白Marker; +, 原核表达的G10evo蛋白; 1、3、5, 非转基因玉米的根、茎、叶; 2、4、6, 转基因玉米AG16根、茎、叶。Fig. 4 Western blot analysis of G10evo protein expression in GM-maize Note: M, Prestained protein ladder; +, G10evo protein expressed in E. coli; 1, 3, and 5, Root, stem and leaves of Non-GM-maize; 2, 4, and 6, Root, stem and leaves of GM-maize AG16.

对生长在温室条件下, 4-5叶期的转基因玉米和非转基因对照玉米分别喷洒相当于大田推荐使用浓度的0、1、2、4和8倍的0、2.05、4.10、8.20和16.40 g· L^-1 5个浓度的草甘膦, 一周后观察其表型差异。

在喷施2.05、4.10、8.20和16.40 g· L^-1浓度的草甘膦1周后, 非转基因玉米对照组全部死亡; 在喷洒2.05、4.10和8.20 g· L^-1浓度的草甘膦1周后转基因玉米, 没有明显的药害(图5), 这说明转G10evo基因玉米具有较高的草甘膦抗性。喷洒16.40 g· L^-1浓度的草甘膦对转基因玉米会产生一定的药害, 叶缘和叶尖枯黄、玉米生长缓慢, 个别心叶有白斑, 但持续2~3周后, 药害逐渐消除, 转基因玉米能恢复正常生长。8倍浓度的草甘膦喷施2~3 d后, 转基因玉米叶片上出现轻微的白斑, 这可能是因为草甘膦的毒害作用, 也有可能是因为8倍田间浓度的草甘膦中, 异丙酰胺盐浓度过高, 使得转基因玉米叶片因为渗透压的作用受到伤害, 导致叶片出现轻微白斑。

图5

Fig. 5

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	图5 转基因玉米AG16的草甘膦抗性Fig. 5 Glyphosate tolerance of GM AG16 maize

图6

Fig. 6

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	图6 草甘膦喷洒前后AG16玉米不同组织的G10evo蛋白表达量Fig. 6 Concentration of G10evo in different tissues of AG16 maize before and after spraying glyphosate

对生长在温室条件下, 4-5叶期的转基因玉米AG16不同组织中G10evo蛋白含量进行ELISA定量检测。结果显示, 在喷洒草甘膦前幼茎组织中G10evo蛋白表达量最高, 为9.975 μ g· g^-1, 其次是第4片叶, 为8.750 μ g· g^-1; 表达量最低的是新生第1和第2片叶, 分别为2.152和2.163 μ g· g^-1。喷洒草甘膦后各组织中的G10evo蛋白表达量均有提高, 但表达量最高的还是在幼茎组织中, 为11.234 μ g· g^-1, 增加12.6%, 最少的为第1片叶, 为3.315 μ g· g^-1, 增加54.0%, 第2片叶为3.524 μ g· g^-1, 增加62.9%, 其余增加量均小于10%(图6)。这说明在草甘膦的刺激下, 幼嫩组织能增加G10evo蛋白的表达量, 以提高对草甘膦的耐受能力。