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刘颖竹, 焦宏彬, 杨雪, 王欢, 刘洋, 张彦妮, 何淼. 野菊和神农香菊毛状体及叶片表面分泌物的比较. 草业科学, 2016,33(4):615-621
Liu Ying-zhu, Jiao Hong-bin, Yang Xue, Wang Huan, Liu Yang, Zhang Yan-ni, He Miao. Comparison of trichomes and their secretion from Dendranthema indicum and D. indicum var. aromaticum . Pratacultural Science,2016,33(4): 615-621  
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野菊和神农香菊毛状体及叶片表面分泌物的比较
刘颖竹, 焦宏彬, 杨雪, 王欢, 刘洋, 张彦妮, 何淼
东北林业大学园林学院,黑龙江 哈尔滨 150040
何淼(1975-),女(满族),辽宁本溪人,副教授,博士,主要从事园林植物的栽培和抗性育种等方面的研究工作。E-mail:hemiao_xu@126.com

第一作者:刘颖竹(1990-),女(满族),河北秦皇岛人,在读硕士生,主要从事园林植物种质资源方面的研究工作。E-mail:814885043@qq.com

收稿日期: 2015-11-03
基金: 黑龙江省自然科学基金面上项目(C2015058); “十二五”国家科技支撑计划课题(2013BAJ12B02)
摘要

本研究以野菊( Dendranthema indicum)和神农香菊( D. indicum var. aromaticum)为研究对象,对比分析了其叶片的表皮毛形态、密度以及叶片表面分泌物种类和含量。结果表明,其叶片表皮毛主要有两种类型,一类是没有分泌功能的T-形非腺毛,一类是具有分泌功能的头状腺毛。T-形非腺毛在上下表皮的密度差异不大,而头状腺毛差异较大,主要集中在叶片的下表皮。两种植物材料叶片表面分泌物里共分析出73种化合物,其中大部分为萜类及其衍生物,共有的化合物有18种;野菊和神农香菊中分别分析出48、43种化合物,分别占分泌物总相对含量的90.96%和84.33%。

关键词: 头状腺毛; T-形非腺毛; 腺毛密度; 叶片表面分泌物
中图分类号:S682.1+1 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)4-0615-07 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0442
Comparison of trichomes and their secretion from Dendranthema indicum and D. indicum var. aromaticum
Liu Ying-zhu, Jiao Hong-bin, Yang Xue, Wang Huan, Liu Yang, Zhang Yan-ni, He Miao
The College of Landscape, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Corresponding author: He Miao E-mail:hemiao_xu@126.com
Abstract

Morphological structure and trichome density of leaves at different age and position in Dendranthema indicum and D. indicum var. aromaticum, were compared by analyzing the type and content of the excretion through GC-MS. The results showed that there were two types of glandular trichomes. One was T-shaped non-glandular hairs without the secretion function, and the other was capitate trichomes with the secretion function. There were little difference between upper and lower epidermis on the density of T-shaped non-glandular hairs, while the capitate trichomes were mainly concentrated in the lower epidermis. There were 73 compounds found in the leaf secretion of the two plants, which included mostly terpenoids and their derivatives, and 18 compounds were shared by the two plants. There were 48 and 43 compounds identified from D. indicum and D. indicum var. aromaticum, respectively, and these compounds constituted 90.96% and 84.33% respectively of the total content of leaves surface exudates.

Keyword: capitate glandular trichomes; T-shaped non-glandular; trichome density; leaf surface exudates

神农香菊(Dendranthema indicum var. aromaticum)是由刘启宏和张树藩[1]在湖北神农架发现并命名的菊科菊属多年生草本植物, 是一种环境适应能力极强的野生草本植物, 花、叶、根都具有浓郁的香气。对神农香菊和野菊(D. indicum)进行核型分析发现, 二者之间的染色体数目及核型十分相似[1], 故初步认定神农香菊为野菊变种。毛状体是大多数植物地上部分表皮组织所特有的结构, 根据分泌功能分为腺毛(Glandular Trichome)和非腺毛(Non-glandular Trichome)两类[2]。叶片表面分泌物的种类和与腺毛的类型、密度和结构密切相关, 毛状体生命周期也不同, 有些部位的毛状体存在一定时间后即自行死亡脱落, 而有些部位却能伴随植物整个生命周期[3]。毛状体的主要作用是减少强光辐射、抵御病原菌入侵和机械阻隔昆虫在植物表面的运动, 分泌粘液或毒素抵御害虫[4]。

次生代谢的产物在植物提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系上充当着重要角色[5], 比如多酚、多糖、萜类、黄酮、生物碱等[6, 7, 8]。植物腺毛分泌物大多为挥发油, 而萜类化合物是构成挥发油的主要物质之一。菊属腺毛及其分泌物组分的含量受遗传因素、发育阶段、环境和栽培条件的影响[9]。同时, 腺毛及其分泌物与芳香物质的合成及抗虫抗病性存在密切关系[10, 11]。因此, 研究不同时期和叶位的腺毛密度及其分泌物含量对芳香物质合成和抗性的影响有重要指导意义。很多菊科植物的表面都有T-形非腺毛的分布[12], 在菊蒿(Tanacetum vulgare)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)和土木香(Inula helenium)等菊科植物的花器官表面也发现有头状腺毛的分布[13]。在紫花野菊(D. zawadskii)的叶表面同时发现了随机分布的T-形非腺毛和多细胞腺毛两类毛状体[14]。在神农香菊的挥发油成分中鉴定出44种化合物, 主要为萜类中的单萜和倍半萜及其含氧衍生物[15]。萜烯类化合物含量占总挥发物成分的80%以上, 其中侧柏酮含量最高, 花、茎、叶香气组成相似, 但各成分含量有所差异[16]。本研究对神农香菊和野菊进行对比, 分析二者腺毛密度变化和分泌物含量之间的相关性, 以期为神农香菊的分泌物合成研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

本研究所用神农香菊和野菊分别引自湖北神农架地区(110° 23'57″ E, 31° 28'07″ N) 和辽宁省本溪市(121° 21'25″ E, 41° 22'48″ N), 在2014年10月中旬用脚芽繁殖, 栽培于东北林业大学园林学院苗圃。

1.2 试验方法

取5盆长势一致、无病虫害的30 d龄植株; 用刀片分别切取每个植株15、45和90 d叶龄的叶子, 用徕卡DM2500荧光显微镜进行观察, 拍照; 观察时按照每个叶片的叶基、叶中、叶尖各取4个视野, 每个视野约1.84 mm2, 5盆植株一共20个视野, 然后进行腺毛密度统计分析。

叶片表面分泌物提取[17]:分别选取45 d叶龄的神农香菊、野菊叶片各10 g, 先后在装有二氯甲烷的3个培养皿中浸提, 在第1个培养皿中浸提3次, 每次浸提2 s, 二氯甲烷稍挥发, 在第2、3个培养皿中重复以上步骤。将浸提液滤至圆底烧瓶, 过滤的滤纸中加入20 g无水硫酸钠, 用旋转蒸发仪在40 ℃的情况下浓缩, 定容至2 mL, 移入琥珀色瓶中置于0 ℃暗处备用。用美国Agilent 7890A-5975C GC/MS气质联用仪对腺毛分泌物进行分析检测:

1)色谱条件 GC条件:色谱柱HP-5MS(30 m× 0.25 mm× 0.25 μ m)弹性石英毛细管柱, 进样量1 μ l, 分流比5∶ 1, 50 ℃保持30 min, 升温速度5 ℃· min-1, 升到160 ℃, 再以10 ℃· min-1升温至270 ℃, 溶剂延迟3.5 min。MS条件:电离方式:EI模式, 四极杆温度150 ℃, 离子源温度230 ℃, 接口温度280 ℃, 电离能量为70 eV, 电子倍增器电压2 100 V, 扫描范围4-500 u, 标准质谱图库NIST08L。

2)物质分析鉴定:根据检测得出的CAS号进行物质成分鉴定, 得到相关数据。

试验数据采用SPSS 19.0和Excel 2007进行统计学分析, 利用Excel 2007进行作图。

2 结果与分析
2.1 毛状体形态结构、类型及分布

扫描电镜下观测发现, 野菊和神农香菊叶片表皮毛状体主要有两种形态(图1):一种是由3~5个柄细胞连接支持的有开口的管形刚毛, 其管形细胞细长, 形成两支臂, 两臂伸展方向、角度不同, 两臂大部分等长, 偶有不对称现象, 形似“ T” 字形, 被称之为“ T-形非腺毛” ; 另一种是由3~8个细胞组成的具有分泌功能的头状腺毛。野菊T-形非腺毛两臂近于平展, 神农香菊两臂角度较小, 并且叶片上表皮头状腺毛数量很少, 下表皮同时有头状腺毛和T-形腺毛的分布。

图1 扫描电镜下野菊、神农香菊叶表毛状体形态与分布Fig.1 The morphology and distribution of the leaf surface trichomes of Dendranthema under scanning electron microscope

2.2 野菊和神农香菊毛状体的密度

2.2.1 T-形非腺毛的密度 在紫外荧光下观察发现, 两种植物材料表皮毛密度表现出较为一致的规律, 野菊和神农香菊各个叶龄叶片的上、下表皮均有T-形非腺毛, 且密度均随叶龄的增加显著减小(P< 0.05), 上表皮密度变化幅度为神农香菊> 野菊, 下表皮密度变化为野菊> 神农香菊。15 d叶龄神农香菊下表皮腺毛密度明显小于上表皮, 野菊上下表皮密度差异不大(表1)。

表1 野菊、神农香菊叶片T-形非腺毛密度(个· mm-2) Table 1 The T-shaped non-glandular trichomes density of leaves of D. indicum, D. indicum var. aromaticum (number· mm-2)

各叶龄野菊、神农香菊T-形非腺毛密度分布规律(表1)表现为, 15和45 d叶龄野菊叶基上表皮T-形非腺毛密度显著小于叶尖和叶中(P< 0.05), 而15 d叶龄神农香菊叶中腺毛密度相较于叶尖和叶中最小, 45 d叶龄的神农香菊上表皮各部位之间差异显著, 下表皮叶尖显著大于叶中、叶基。90 d叶龄的野菊上表皮叶尖显著小于叶中和叶基, 神农香菊上表皮叶基显著小于叶尖和叶中; 野菊下表皮叶基显著大于叶尖和叶中, 神农香菊下表皮叶中和叶基显著大于叶尖。

2.2.2 头状腺毛密度 野菊、神农香菊头状腺毛主要集中在下表皮, 野菊上表皮数量不超过1个· mm-2, 下表皮至少为4.88个· mm-2, 神农香菊上表皮腺毛最多为3.27个· mm-2, 下表皮最多可达8.61个· mm-2。野菊头状腺毛的密度随叶龄变化规律不明显; 而神农香菊的上表皮头状腺毛数量随叶龄的增加而增加, 下表皮呈现先增加后减少的规律, 但增加数量明显大于上表皮。15 d叶龄的野菊和神农香菊叶尖、叶中、叶基上表皮头状腺毛密度均基本为0, 而下表皮野菊明显大于神农香菊; 45和90 d叶龄的神农香菊上表皮腺毛明显多于野菊, 说明神农香菊腺毛增加速度更快。

表2 野菊、神农香菊头状腺毛密度 Table 2 The capitate glandular trichome density of leaves of D. indicum and D. indicum var. aromaticum

2.2.3 叶片毛状体密度 野菊和神农香菊头状腺毛密度显著少于T-形非腺毛(P< 0.05), 最大时仅为4.57 个· mm-2, 而T-形非腺毛最大可达33.42 个· mm-2, 其中神农香菊15 d叶龄时T-形非腺毛与头状腺毛的比值高达27.39, T-形非腺毛占腺毛总量的96.5%。野菊与神农香菊的叶表T-形非腺毛密度随叶龄变化差异显著, 均随叶龄的增加而显著下降, 上、下表皮规律相同(表3)。

表3 野菊、神农香菊叶片表皮腺毛密度和组成比例 Table 3 Trichome density and composition proportion in the epidermis of chrysanthemum leaf

2.2.4 野菊、神农香菊叶片表面分泌物 从野菊、神农香菊叶片表面分泌物中共分析出73种化合物, 其中大部分为萜烯类及其衍生物, 另外还有一些脂肪族和少量芳香族化合物, 化学成分差异较大, 其中共有的化合物有18种(表4), 主要有吉马烯、Naphthalene, 1, 2, 4a, 5, 6, 8a-hexahydro-4, 7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-、Azulene, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8-octahydro-1, 4-dimethyl-7-(1-methylethylidene)-, (1S-cis)-、δ -杜松烯、白菖烯等, 其中单萜及其衍生物的含量要高于其它几种类型的化合物。

表4 野菊和神农香菊叶片叶片表面分泌物化学成分及相对含量 Table 4 The chemical composition and relative content of the secretions of leaves glandular hairs on D. indicum and D. indicum var. aromaticum

含量大于3%的叶片表面分泌物共18种, 其中独有且含量较高(> 3%)的化合物野菊中有5种, 神农香菊中有6种。本研究从野菊中共分析出48种化合物, 占叶片表面分泌物总相对含量的90.96%, 其中含量最高的物质是α , β -侧柏酮(9.63%); 从神农香菊中分析出43种化合物, 占叶片表面分泌物总相对含量的84.33%, 其中含量最高的物质是桉叶油醇(10.99%)。

3 讨论与结论

菊花腺毛与植物本身抗性密切相关, 而且腺毛的密度和分布主要取决于植物生境, 神农香菊主要分布于湖北神农架地区, 是野菊的一种, 所以腺毛密度与野菊相似, 腺毛主要削弱和反射强烈光线、防止植物体温过分升高, 同时能够防止水分的过度蒸发, 起到减少水分蒸腾的作用; 具有分泌功能的头状腺毛能分泌粘液、挥发油和其它物质, 可防御虫害对其的侵袭[18]。

本研究对比了神农香菊和野菊叶表腺毛的形态、分布和密度, 验证了植物表皮毛分为T-形非腺毛和头状腺毛。试验所用不同叶龄叶片T-形非腺毛密度会随着叶龄的增加而显著减少, 头状腺毛下表皮密度随时间变化呈现出不同的规律, 神农香菊下表皮头状腺毛反而呈现出先增加后减少的趋势, 说明神农香菊幼叶期分泌功能很弱甚至没有, 直至一定成熟期才具备分泌功能, 这可能使其具有更强的环境适应能力。腺毛密度大小与叶片表面分泌物的量呈正相关。对烟草(Nicotiana tabacum)的研究表明, 烟叶腺毛密度大, 叶片表面分泌物的量也大, 芳香油的含量就多, 致香物质就较为丰富[19]。不同叶位的烟叶具有不同的香气品质特征, 一般上部烟叶油分充足[20]。本研究发现, 野菊的叶片表面分泌物中α , β -侧柏酮含量最高, 并且通过腺毛散发到空气中, 这与神农香菊自然香气的主要成分测定结果[16]相符, 但本研究中神农香菊未鉴定出α , β -侧柏酮, 此种差别可能与测定方法或分泌物合成酶基因的特异性表达有关。

此外, 野菊和神农香菊的叶片表面分泌物差异很大, 共有的化合物仅有18种, 植物分泌物合成受腺毛形态、结构和密度以及环境等多种因素综合影响, 故菊属的分泌物合成机理尚有待进一步查明, 下一步研究工作可从遗传学和生理学多个角度进行探究。菊属植物分泌物合成机制的研究, 将为多年生草本植物的开发利用提供理论指导。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 刘启宏, 张树藩. 神农架菊属一新变种. 武汉植物学研究, 1983, 1(2): 237-238. [本文引用:2]
[2] Werker E. Trichome diversity and development. Advances in Botanical Research, 2000, 31: 1-35. [本文引用:1]
[3] 张雪荣, 谭四军, 吴韩英, 胡鸢雷, 慈忠玲, 林忠平. 植物腺体的萜类代谢工程. 生物技术通报, 2007(3): 49-51.
Zhang X R, Tan S J, Wu H Y, Hu Y L, Ci Z L, Lin Z P. Metabolic engineerng of gland ular trichome in plants. Biotechnology Bulletin, 2007(3): 49-51. (in Chinese) [本文引用:1]
[4] Simmons A T, Gurr G M. Trichome-based host plant resistance of Lycopersicon species and the biocontrol agent Mallada signata: Are they compatible. Entomologia experimentaliset Applicata, 2004, 113(2): 95-101. [本文引用:1]
[5] 吴能表, 李琳琳, 杨卫星, 周忆堂. 光强对长春花叶片碳氮及次生代谢产物累的影响. 草业科学, 2014, 31(8): 1508-1514.
Wu N B, Li L L, Yang W X, Zhou Y T. Effects of light intensity on carbon-nitrogen metabolism and secondary metabolite of Catharanthus roseus leaves. Pratacultural Science, 2014, 31(8): 1508-1514. (in Chinese) [本文引用:1]
[6] 王成龙, 周美亮, 邵继荣, 吴燕民. 植物毛状根的诱导及应用. 草业科学, 2015, 32(5): 770-779.
Wang C L, Zhou M L, Shao J R, Wu Y M. The induction and application of plant hairy roots. Pratacultural Science, 2015, 32(5): 770-779. (in Chinese) [本文引用:1]
[7] Johnson A W, Severson R F, Hudson J. Tobacco leaf trichomes and their exudates. Tobacco Science, 1985, 29: 67-72. [本文引用:1]
[8] Robberecht R, Caldwell M M. Protective mechanisms and accumulation to solar ultraviolet-B radiation in Oenotherzn strieta. Plant, Cell & Environment, 1983, 6: 477-485. [本文引用:1]
[9] 李雅菲, 邢梅, 张蝶, 李杰, 王彩云. 几种菊属植物叶表毛状体形态观察的比较. 中国观赏园艺研究进展. 北京: 中国园艺学会, 2009: 423-428. [本文引用:1]
[10] 史宏志, 官春云. 烟草腺毛分泌物的化学成分及遗传. 作物研究, 1995, 9(3): 46-49.
Shi H Z, Guan C Y. The chemical composition of tobacco gland ular trichome secretion and genetic. Crop Research, 1995, 9(3): 46-49. (in Chinese) [本文引用:1]
[11] Alvarez-Castellanos P P, Bishop C D, Pascual-Villalobos M J. Antifungal activity of the essential oil of flowerheads of garland chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium) against agricultural pathogens. Phytochemistry, 2001, 57(7): 99-102. [本文引用:1]
[12] Metcalfe C R, Chalk L. Anatomy of the Dicotyledons. Oxford: United Kingdom, 1979. [本文引用:1]
[13] Spring O. Chemotaxonomy based on metabolites from gland ular trichomes. Advances in Botanical Research, 2000, 31(4): 153-174. [本文引用:1]
[14] 于丽杰, 张大维. 紫花野菊叶上毛状体的发育形态学研究. 西北植物学报, 1996, 16(4): 412-414.
Yu L J, Zhang D W. The developmental morphology on the trichomes of the leaves in Dendranthema zazwadskll(herd. )tzvel. Acta Botanica Boreai-Occidentalia Sinica, 1996, 16(4): 412-414. (in Chinese) [本文引用:1]
[15] 卢金清, 李竣. 神农香菊的挥发油化学成分. 中国中药杂志, 2002, 27(8): 598-599.
Lu J Q, Li J. Chemical constituents in volatile oil from the flos of Dendranthema indicum var. aromaticum var. nov. China Journal of Chinese Materia Medica, 2002, 27(8): 598-599. (in Chinese) [本文引用:1]
[16] 菅琳, 孙明, 张启翔. 神农香菊花, 茎和叶香气成分的组成分析. 西北农林科技大学学报 (自然科学版), 2014(11): 88-92.
Jian L, Sun M, Zhang Q X. Analysis on aroma compositions in flowers, stems and leaves of Chrysanthemum indicum var. aromaticum. Journal of Northwest A & F University(Natural Science Edition), 2014(11): 88-92. (in Chinese) [本文引用:2]
[17] 孔光辉. 烤烟烟叶腺毛分泌物提取方法初探. 植物生理科学, 2006, 12(22): 62-65.
Kong G H. Study on the extraction method of leaf trichome exudates in flue-cured tobacco. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2006, 12(22): 62-65. (in Chinese) [本文引用:1]
[18] 吕明月. 神农香菊遗传转化体系的建立及其叶片表皮毛初步研究. 哈尔滨: 东北林业大学硕士学位论文, 2013.
Lyu M Y. Studies on establishment of genetic transformation system of Dendranthema indicum var. aromaticum and preliminary study of epidermal hair. Master Thesis. Harbin: Northeast Forestry University, 2013. (in Chinese) [本文引用:1]
[19] 王瑞新. 烟草化学. 北京: 中国农业出版社, 2003: 77-79.
Wang R X. Tobacco Chemistry. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 77-79. (in Chinese) [本文引用:1]
[20] 孔光辉, 宗会. 不同部位成熟烟叶腺毛密度及其分泌物的研究. 植物生理科学, 2006, 22(12): 108-110.
Kong G H, Zong H. Study on the density and exudates of gland ular trichome of mature tobacco leaves with different stalk positions. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2006, 22(12): 108-110. (in Chinese) [本文引用:1]