引用本文
谌恩华, 吴华伟, 李相前. 结晶纤维素的降解. 草业科学, 2016,33(11):2367-2374
Shen En-hua, Wu Hua-wei, Li Xiang-qian. Advance in research on degradation of crystalline cellulose. Pratacultural Science,2016,33(11): 2367-2374  
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《草业科学》编辑部
结晶纤维素的降解
谌恩华1, 吴华伟1, 李相前2
1.长江大学生命科学学院,湖北 荆州 434025
2.淮阴工学院生命科学与化学工程学院,江苏 淮安 223003
通讯作者:吴华伟(1977-),男,湖北荆州人,副教授,博士,主要从事微生物工业酶基因资源发掘及利用研究。E-mail:wuhuawei-2000@163.com

第一作者:谌恩华(1990-),男,湖北麻城人,在读硕士生,主要从事纤维素酶基因的发掘以及工程改造。E-mail:1135384059@qq.com

收稿日期: 2016-08-30
基金: 国家自然科学基金(21576110); 生物质转化与过程集成工程实验室开放课题(JPELBCPL2014007)
摘要

随着化石能源的日益消耗及其对环境的污染加重,寻求可再生的清洁能源已成为各国关注的焦点。木质纤维素是地球上最多的有机聚合物,对于解决能源危机具有巨大的潜力,但没有得到有效的利用,纤维素结晶区的存在是阻碍其降解的重大难题。本文介绍了结晶纤维素的结构、解结晶方法及优良的降解菌种;纤维素酶的结构和功能;降解结晶纤维素的机制;纤维素酶的基因工程和酶工程改造。突出应加大对耐热、高效的结晶纤维素降解菌株的挖掘,并深入探究碳水化合物结合结构域的相关作用机理,这对结晶纤维素的高效降解具有重要意义。

关键词: 结晶纤维素; 纤维素酶; 降解机制; 碳水化合物结合结构域; 纤维小体; 膨胀因子; 可再生能源
中图分类号:X172 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)11-2367-08 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0310
Advance in research on degradation of crystalline cellulose
Shen En-hua1, Wu Hua-wei1, Li Xiang-qian2
1.College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China
2.Faculty of Life Science &Chemical Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China;
Corresponding author:Wu Hua-wei E-mail:wuhuawei-2000@163.com
Abstract

Due to increased consumption of fossil energy and its pollution to the environment seeking renewable and clean energy has become the focus of attention in many countries. Lignocellulose is the most organic polymer on the earth, which has great potential for solving the energy crisis, but it has not been effectively used, the existence of the crystalline region of cellulose is a major problem hindering its degradation. This paper introduces the structure of crystalline cellulose, decrystallization method and potent degradation strain; the structure and function of cellulase; degradation mechanism of crystalline cellulose; genetic engineering and enzyme engineering modification of cellulase. It is underlined that should increase to excavate for the excellent, thermostable cellulose-degratdaion strains and thorough study of related function mechanism of carbohydrate binding module, it is of great significance for the efficient degradation of crystalline cellulose.

Keyword: crystalline cellulose; cellulase; mechanism of degradation; carbohydrate binding module; cellulosome; swollenin; renewable energy

随着全球经济的飞速发展, 全球能源消耗量基本处于上升态势。中国作为世界上人口最多的国家, 能源的消耗量逐年增加[1]。化石燃料是不可再生能源, 但是目前消耗的能源以及塑料材料大多来自化石燃料, 石油、天然气和煤炭等化石燃料储量分别仅够全球使用42、60和113年[2], 使得其价格也逐渐上升。另外, 化石燃料燃烧释放的CO2、SO2等气体可引发全球气候变暖、酸雨、生物多样性降低、臭氧圈破坏、生物圈碳平衡破坏等环境危害。相比化石能源, 生物质能源具有清洁、安全、可再生等优点, 对能源的可持续发展具有促进作用[3]。生物质是地球上最丰富的可再生资源, 其中木质纤维素含量最多、成本低廉并且来源广泛(如农作物秸秆、森林凋落物、草类和一些生活垃圾等)。据推测, 生物质世界年产总量为1 700亿t, 将其作为能源开发有着很好的前景[4, 5]。

植物细胞壁中的天然纤维素多是以结晶纤维素的形式存在, 结构整齐致密, 形成了天然的抗降解屏障[6, 7], 水分子、化学试剂和纤维素水解酶根本无法进入到纤维素内部, 即使再多的酶和再高的酶活也难以发挥催化作用[8, 9]。因此, 有效降解、转化天然纤维素的关键在于尽量快速破坏天然纤维素的这种致密的结晶结构, 暴露出纤维素多糖链、纤维素酶等起水解作用的成分才能发挥作用。近些年, 国内外对于结晶纤维素降解的研究已取得了巨大的进展, 本文就结晶纤维素的结构、纤维素酶的降解机制、基因工程和酶工程改造等方面进行综述, 以期对其发展作出展望。

1 纤维素的结晶结构及其降解菌
1.1 纤维素的结晶结构

纤维素是地球上含量最多的有机聚合物, 是葡萄糖单位通过β -1, 4-糖苷键连接而成的线形长链分子, 每个分子通常含数千个葡萄糖单位, 构成纤维素糖链的葡萄糖残基含有多个羟基, 加上纤维素多糖链是无分支的直线形分子, 这就使得纤维素多糖链上的羟基趋于整齐、有序排列, 羟基中的氢易与葡萄糖残基中的氧形成氢键, 这种氢键不但存在于同一纤维素多糖链内部, 也存在于相邻的纤维素多糖链之间, 就这样大量氢键形成的有序网络结构使得天然纤维素纤维中的多糖链紧密、有序地结合在一起, 并进一步形成纤维素致密、稳定、抗分解的结晶结构。与纤维素内形成结晶结构的纤维素结晶区相对, 不能形成有序结晶结构的部分就是纤维素的非结晶区, 或称为无定形区。结晶区内的纤维素多糖链稳定性较强, 难于被分解, 甚至水和分解酶等分子都不能与结晶区内的多糖链接触。而非结晶区的多糖链易与其它分子接触, 易于被分解, 其被分解的速度远高于纤维素结晶区[10, 11, 12]。

1.2 纤维素的结晶度和解结晶

纤维素的结晶度是指纤维素中的结晶区占其总体积的百分比, 与纤维素的物理化学性质密切相关, 是描述纤维素超分子结构的重要参数[13]。结晶区阻止了酶的可及性, 温度升高能增加纤维素酶的吸附[14], 但高温可以使酶活性降低甚至失活。有研究[15]发现, 相比提高温度, 解结晶更能增加酶的吸附率。这说明降低纤维素结晶度是提高酶吸附率的一个较好的方法, 从而更好地促进结晶纤维素的降解。纤维素结晶度的测试方法主要有X-射线衍射法、红外光谱法、CP/MAS13C-NMR方法等[12, 13], 解结晶方法有:机械粉碎、蒸汽爆破以及微波、超声波、酸、碱和生物处理等[12, 16]。据最新研究[17], 超声与Fenton试剂联合对微晶纤维素预处理后进行酶解, 还原糖的产量高达22.9 g· 100 g-1。对纤维素预处理的方法很多, 寻求更好的生物方法或者最优的联合处理方法对纤维素进行预处理破坏其结晶结构, 这对于结晶纤维素的酶解有重要意义。

1.3 结晶纤维素的降解菌

结晶纤维素降解菌种类繁多, 以产游离纤维素酶的Caldicellulosiruptor属、产纤维小体的热纤梭菌属(Clostridium)、产膨胀因子的木霉属(Trichoderma)和以细胞结合型降解机制的哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)等最为典型。由于嗜热菌和极端嗜热菌的纤维素酶具有稳定性好、半衰期长, 并且对结晶纤维素有很强的降解能力等优良特性[18], 加之高温能提高降解菌的生长和代谢速率、降低杂菌污染概率, 并且便于乙醇分馏等[19], 使得这类菌种在木质纤维素转化为乙醇燃料的统合加工过程中具有明显的优势, 引发了国内外对这类菌的广泛研究。表1中为近5年来国内外对耐热纤维素降解菌株的研究成果, 这些菌株主要来自温泉、牲畜肠胃及粪便、腐殖质土壤、生物堆肥及污泥中, 并且以细菌居多。

表1 近5年来国内外对耐热纤维素降解菌的挖掘 Table 1 Excavation of thermostable cellulose-degratdaion strains in recent five years all over the world
2 结晶纤维素的降解机理
2.1 纤维素酶分子的结构和功能

绝大多数纤维素酶由三大部分组成:月球状的催化结构域(catalytic domain, CD)和没有催化作用的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding module, CBM)和连接肽(Linker); 少数纤维素酶不具备CBM结构, 如分别来自A. acidocaldarius、T. maritima的内切纤维素酶Cel9A和Cel5A[32]。

2.1.1 催化结构域 CD对纤维素水解具有催化活性, 对底物具有特异性。利用X光衍射法分析Clostridium thermocellum的纤维素酶CD[33]时发现, 纤维素酶复合物的外切酶活性位点位于一个长环所形成的隧道里, 它只能从纤维素的非还原性末端切下纤维二糖, 内切酶的活性位点位于开放的裂缝中, 可与纤维素链的任何部位结合并将其切断。这种特殊的隧道结构可以连续催化完成多个糖苷键的断裂[34]。

2.1.2 碳水化合物结合结构域 CBM是没有催化活力, 但有识别多糖能力并可以调节催化结构域酶活的蛋白质单位, 是纤维素酶最重要的模块之一, 位于酶肽链的N端或C端, 少数位于中间, 通过连接肽与CD相连[35, 36]。最初发现附在细胞壁水解酶上的CBM能极大地提高酶对不可溶底物的催化活性[37, 38, 39], 其提高纤维素酶活性的机制主要有邻近效应、靶向作用、松解功能[40]。随后一些研究者提出CBM是一种膨胀因素, 通过破坏氢键来分离结晶纤维素的葡聚糖链使其逐层降解[41, 42]。通过不同菌株来源的CBM删除和替代试验[43]发现CBM既能提高纤维素酶酶活, 也能抑制酶活, 说明CBM具有酶和底物特异性。Reyes-Ortiz等[32]将CBM融入到不含CBM的内切纤维素酶中发现酶活提高了3倍, CBM不仅能够提高纤维素酶在纤维素的表面吸附, 还能提高酶对纤维素的贯穿能力从而提高CD的催化效率。相比促进纤维素酶与底物的吸附, CBM提高纤维素酶酶活的机制更加复杂需进一步研究。

2.1.3 连接肽 纤维素酶的CD与CBM之间通过一段相当长、高度糖基化的连接肽(Linker)连接, 真菌纤维素酶的Linker主要由大量的Pro、Ser和Thr重复组成, 细菌的Linker则富含Pro和Thr[44], 细菌Linker的Pro含量是真核生物的两倍多, 但是有更少的O-糖链。尽管Linker修饰可以改变纤维素酶活, 但是Linker的功能作用还需要进一步研究[45]。

2.2 降解机制

对纤维素的降解机制研究得比较透彻的有两种, 即好氧菌的游离纤维素酶的协同降解机制和厌氧菌的纤维小体(纤维素多酶复合体)降解机制, 此外有研究显示, 存在一种细胞结合型非纤维小体的纤维素降解机制[46]。

2.2.1 游离纤维素酶降解机制 游离的纤维素酶降解机制是利用真菌和细菌产生大量胞外酶对纤维素进行降解。纤维素酶协同降解是指3类纤维素酶之间的协同作用, 即内切-β -1, 4-葡聚糖酶(endo-β -1, 4-glucanase, EG)、外切-β -1, 4-葡聚糖酶(exo-β -1, 4-glucanase, CBH)和β -葡萄糖苷酶(β -glucosidases, BG)之间的协同, 纤维素酶与CBM之间也存在协同作用[47]。

2.2.2 纤维小体降解机制 纤维小体是水解结晶纤维素和植物细胞壁多糖的高活性的多酶复合体。这种多酶复合体内含有各种纤维素和半纤维素降解酶, 并以一种连续有序的方式排列, 因而在纤维素及半纤维素的降解中具有高度的协同作用[48]。纤维小体主要由两部分组成, 一部分为无催化活性的支架蛋白(scaffoldin), 上面有多个粘连模块(cohesin), 能够与酶分子的对接模块(dockerin)特异性结合; 另一部分为有催化活性的各种酶。纤维小体复合酶中的CD通过粘连模块和对接模块的相互作用形成超分子复合物(图1), 复合物中的不同CD间协同作用完成对结晶纤维素的高效降解[49, 50], 但各组分如何协同发挥作用仍不明确。

图1 纤维小体对纤维素的催化机制[38]Fig.1 Catalytic mechanism of cellosome acting on cellulose[38]

2.2.3 细胞结合型非纤维小体的纤维素降解机制 Wilson[46]发现, 好氧的哈氏噬纤维菌和厌氧的产琥珀酸丝状杆菌(F. succinogenes)对纤维素的降解机制与上述两种均不相同。这两种菌对纤维素的降解依赖于对纤维素的直接接触, 且胞外几乎没有还原糖的产生, 但都可以对结晶纤维素进行高效降解。两种细菌既不分泌胞外游离的纤维素酶也不产生纤维小体, 但它们的纤维素酶与细胞密切相关, 推测可能存在一种新的纤维素降解机制, 有待进一步的研究[47]。

2.2.4 膨胀因子的辅助降解 膨胀因子(swollenin)最初由Saloheimo在纤维素降解真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)中发现[34], 其序列和功能都与植物膨胀素(expansin)相近。在swollenin蛋白质结构的N-端是一个能与纤维素可逆性结合的真菌CBM结构, 而C-端结构与植物膨胀素蛋白结构域类似。研究表明, swollenin能降低滤纸的强度, 能造成纤维结构的局部破坏, 且不产生还原糖。因此说明, swollenin可能破坏结晶纤维素的氢键网络结构, 打开纤维素纤维的交连耦合[34]。研究还发现, swollenin还可以与内切纤维素酶协同作用降解结晶纤维素, 通过检测产生的还原糖的释放量来定量分析swollenin的非水解性松解活力[51, 52]。最近研究发现, swollenin对纤维素底物有类似于内切纤维素酶和纤维二糖水解酶的水解活性[53]。

2.2.5 纤维素氧化降解机制 早在1965年, Halliwell[54]发现, Fenton反应产生的羟基自由基对纤维素有很强的降解能力, 并得到了王蔚等[55]的验证。国内有研究[56]表明, 羟基自由基能使纤维素产生大量的还原性末端, 并在一定程度上破坏纤维素分子间的氢键结构, 在生物反应体系中羟基自由基氧化降解机制更加复杂, 需要进一步的研究。

3 结晶纤维素酶的基因工程和酶工程

天然纤维素酶普遍活性不高并且产量低, 随着分子生物学和基因工程技术的发展, 为纤维素酶的研究开创了新前景。降解纤维素的微生物中, 相对细菌而言, 真菌有能大量合成纤维素酶、发酵时间长、培养困难等特点, 因此可将真菌的纤维素酶基因在细菌中进行异源表达, 如黄时海等[57]成功克隆到康氏木霉纤维二糖水解酶I(cbhI)基因, 实现了在大肠杆菌中的表达。纤维素酶的酿酒酵母表达系统可以将纤维素最终转化为酒精, 在纤维素乙醇燃料的生产过程中, 简化了工艺流程, 降低了水解和发酵成本[58]。如Tang等[59]在酿酒酵母中表达了分别来自S. fibuligera、A. niger Nip35和T. reesei QM9414的BG, 结果来自S. fibuligera的BG可以分泌到胞外, 培养72 h酶活达到5.2 U· mL-1, 比之前报道过的的酶活要高很多。同时基因敲除以及定点突变等技术手段能够确定纤维素酶中的特定基因的功能, 如张聪[47]利用同源双交换的方式将C. hutchinsonii的chu-2103敲除, 与野生型菌株对比检测发现chu-2103是C. hutchinsonii降解纤维素过程中主要的内切纤维素酶, 但是并非关键或者必需的纤维素酶, 并且分析出chu-2103极可能分布于C. hutchinsonii的菌体表面。

蛋白质工程是结晶纤维素降解酶走向工业化生产的一条重要途径, 它主要包括:1)定点突变技术确定催化过程中的功能性氨基酸, 如张聪[47]通过构建chu-2103氨基酸定点突变体发现chu-2103吸附纤维素以及持续性降解的关键氨基酸为W197; 2)研究酶的稳定性, 如王坤[60]通过分子改良技术有效提高了木聚糖酶XynAS9的热稳定性; 3)增减或修饰酶分子的某些结构, 如Reyes-Ortiz等[32]和Crouch等[43]的CBM的融入、删除和替代试验以及Sammond等[45]的Linker修饰试验等都能改变纤维素酶的活性。

4 结晶纤维素降解的研究展望

结晶纤维素的致密结构形成了抗降解的天然屏障, 阻碍了酶的可及性, 导致酶解效率低下, 使其难以被降解。因此, 降解结晶纤维素的关键在于提高酶的可及性, 即提高酶在纤维素链上的吸附量, 从而达到提高酶解效率的目的。提高酶的吸附量有两种方式, 一是降低木质纤维素的结晶度, 二是提高温度。在降低结晶度的方法中, 物理法往往涉及到能量损耗问题, 化学方法可能造成污染以及对后期的酶解产生抑制作用, 而生物方法可以弥补这些不足。生物方法中纤维素酶的CBM结构、木霉产生的swollenin以及褐腐菌通过Gt因子产生的羟基自由基都能破坏纤维素的氢键结构, 使得纤维素的结晶度或聚合度下降。提高温度可以提高酶的吸附量, 但高温可以使酶失活, 因此, 对于耐高温的纤维素酶及其产生菌株的挖掘尤为重要。通过最好的生物法或者联合处理方法来降低木质纤维素的结晶度, 并且通过对产酶条件优化以及构建工程菌种来提高酶的活性和热稳定性, 从而达到高效降解结晶纤维素的目的。CBM结构具有增加纤维素酶在纤维素链上的吸附、提高相关纤维素酶的酶活以及破坏木质纤维素的结晶结构等功能, 对结晶纤维素的降解十分重要, 并且具有CBM结构的swollenin特别是纤维小体对于结晶纤维素具有很强的降解作用。因此应该研究透彻CBM与纤维素酶的协同作用、CBM如何提高相关纤维素酶的活性以及纤维小体内的各酶组分如何发挥协同作用, 并利用蛋白质组学分析鉴定在木质纤维素降解中起关键作用的蛋白质, 这对于通过蛋白质工程手段构建具有高效降解结晶纤维素的酶系具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

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