反刍动物食糜肽氮含量测定方法
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早在1956年就有研究发现，绵羊采食后的短时间内瘤胃液中含有大量的非蛋白质、非氨态氮物质[1]，直到1987年Chen等[2]研究发现，瘤胃液中存在肽形态的氮，至此瘤胃内肽的代谢在国外被广泛关注。肽和游离氨基酸可刺激细菌的生长，能加快微生物蛋白的合成，细菌总是优先摄取肽而不是游离氨基酸，且肽比氨基酸更能刺激瘤胃微生物的生长[3]。测定肽含量常用的方法有双缩脲法、OPA法(邻苯二甲醛法)、紫外吸收法和差量法，在饲料[4]、食品[5]及药物[6]中已有报道。双缩脲法测定速度较快，但是灵敏度较差，不能区别大分子蛋白残留和小分子肽；OPA适用于乳源性的多肽测定；紫外吸收法简便、灵敏，但易受有机物干扰。因此目前应用较多的肽氮的测定方法主要为差量法，即样品通过浸提处理、蛋白质大分子沉淀后，测定上清液总氮及氨态氮的含量，二者差值即为肽氮含量[4]。此外，尽管目前针对豆粕等饲料已建立了测定其中肽氮含量的方法，但反刍动物采食的饲料在瘤胃内被降解或整合，该方法并不适用于测定反刍动物消化道食糜肽氮，建立一种准确、快速的检测方法，对反刍动物蛋白质营养的深入研究尤为必要。为此，本研究采用差量法原理，对样品前处理因素Tris-HCl缓冲液浓度、pH、料液比和浸提时间进行优化，旨在筛选测定牛胃食糜内肽氮含量的适宜参数，为反刍动物食糜内肽氮含量的测定提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
Tris-HCl缓冲液、三氯乙酸、硼酸、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿、乙酸、乙酸钠、甲醇、乙酰丙酮和硫酸铵。
1.1.2 仪器
SCIENTZ-10ND冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Satorius BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，烘箱(上海精宏实验设备有限公司)，摇床振荡器(赛默飞世尔科技公司)，Sigma 2-16KL离心机(济南来宝医疗器械有限公司)，消煮炉、K9840自动凯氏定氮仪(济南海能仪器股份有限公司)，BioTek酶标仪(西安腾领生物科技有限公司)，HH-S6型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，SX620笔式pH计(成都锐新仪器仪表有限公司)。
1.2 设计
参照蔡文君等[6]的方法，通过Tris-HCl缓冲液浸提食糜内含氮物质。影响Tris-HCl缓冲液浸提效果的因素有Tris-HCl缓冲液浓度、Tris-HCl缓冲液pH、料液比和浸提时间，料液比为食糜与Tris-HCl缓冲液的比值，浸提时间为Tris-HCl缓冲液浸提食糜内含氮物质的时间，故本研究选择Tris-HCl缓冲液浓度(A)、缓冲液pH (B)、料液比(C)、浸提时间(D)这4个因素，试验因素及水平如表1所列，L9(34)正交试验设计如表2所列。
表 1 试验因素水平设计Table 1. Experimental design of the different factors水平 Level A B C D 1 0.02 6.8 1∶15 40 2 0.04 7.4 1∶20 60 3 0.06 8.0 1∶25 80 A，缓冲液浓度(mol·L–1)；B，缓冲液pH；C，料液比；D，浸提时间(min)；下同。
A, Tris-HCl buffer concentration (mol·L–1); B, Tris-HCl buffer pH; C, ratio of dry digesta to Tris-HCl buffer; and D, extraction time (min); similarly for the following tables and figures.表 2 本试验相关因素正交试验设计表Table 2. Orthogonal experimental design of the related factors处理 Treatment A B C D T1 1 1 1 1 T2 1 2 2 2 T3 1 3 3 3 T4 2 1 2 3 T5 2 2 3 1 T6 2 3 1 2 T7 3 1 3 2 T8 3 2 1 3 T9 3 3 2 1 1.3 方法
1.3.1 食糜样品及动物饲养管理
食糜供试动物为4头西门塔尔肉牛，试牛屠宰前长时间(60 d)饲喂青贮组合型全混合日粮[7]，试牛育肥出栏后于屠宰场屠宰，即刻采集瘤胃和皱胃食糜样品，液氮保存，运至实验室后用冷冻干燥机冻干，粉碎，过0.425 mm筛以备肽氮测定。
1.3.2 食糜样品中含氮物质的浸提及大分子蛋白的去除
称取0.400 0 g食糜样品，依据前述试验正交设计方案，分别对食糜样品进行9种处理，并通过震荡[8]进行浸提，浸提后于35 ℃、4 000 r·min–1离心20 min，收集上清液并定容至50 mL，即为9种不同条件处理下的含氮物质浸提液。分别量取10 mL浸提液，加入20 mL的TCA溶液，在室温下静置30 min，于35 ℃、4 000 r·min–1离心20 min，收集上清液并定容至50 mL，从中分别量取2 mL用于总氮及氨基酸态氮的测定。
1.3.3 上清液中总氮的测定
用凯氏定氮法测定上清液中总氮含量[9]。
1.3.4 上清液中氨基酸态氮的测定
用比色法测定上清液中游离氨基酸态氮含量[10]。
1.3.5 数据分析
${X_1} = \frac{{\left( {{V_1} - {V_2}} \right) \times {\rm{c}} \times 0.014}}{{{m_1} \times {V_6}/{V_5} \times {V_4}/{V_3}}} \times 100{\text{%}}{\text{。}}$
式中：X1为试样中总氮含量(%)；m1为称取样品的质量(g)；V1为样品消耗盐酸标准液的体积(mL)；V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积(mL)；V3为浸提后定容体积(mL)；V4为量取浸提液体积(mL)；V5为去除大分子蛋白上清液定容体积(mL)；V6为测定试样上清液体积(mL)；c为盐酸标准溶液的浓度；0.014为1 mol·L–1盐酸标准溶液1 mL相当于氮克数。
${X_2} = \frac{{{m_2}}}{{{m_1} \times 1\;000 \times 1\;000 \times {V_6}/{V_5} \times {V_4}/{V_3}}} \times 100{\text{%}}{\text{。}}$
式中：X2为试样中氨基酸态氮的含量(%)；m2为试样测定液中氮的质量(μg)。
$ \begin{split} &{X_3} = {X_1} - {X_2} = \frac{{100}}{{{m_1} \times {V_6}/{V_5} \times {V_4}/{V_3}}} \times\\ &\quad\left[ {\left( {{V_1} - {V_2}} \right) \times c \times 0.014 - {m_2} \times {{10}^{ - 6}}} \right] \end{split}{\text{。}}$
式中：X3为试样中肽氮的含量。
数据经Excel 2003初步整理后，采用Design-Expert软件进行ANOVA分析[11]。
2. 结果与分析
2.1 瘤胃食糜内肽氮含量及极差分析
本研究条件下测得的牛瘤胃食糜肽氮的最大值为14.97 mg·g–1，最小值为2.65 mg·g–1 (表3)。最优条件为T7：Tris-HCl缓冲液浓度0.06 mol·L–1、Tris-HCl缓冲液pH 6.8、料液比1∶25、浸提时间60 min。各因素对肽氮测定结果均有显著影响，影响程度表现为A > C > B > D，即对Tris-HCl浸提法影响最明显的因素是Tris-HCl缓冲液浓度和料液比(P ≤ 0.001)，其次为Tris-HCl缓冲液pH和浸提时间(P < 0.05) (表4)。
表 3 肉牛瘤胃食糜肽氮正交试验结果Table 3. Orthogonal test results for the determination of the peptide nitrogen contents in beef cattle rumen digesta处理 Treatment A B C D 肽氮Peptide nitrogen/(mg·g–1) T1 1 1 1 1 2.65 ± 0.05 T2 1 2 2 2 3.96 ± 0.14 T3 1 3 3 3 3.73 ± 0.11 T4 2 1 2 3 7.34 ± 0.25 T5 2 2 3 1 11.96 ± 0.29 T6 2 3 1 2 6.77 ± 0.25 T7 3 1 3 2 14.97 ± 0.05 T8 3 2 1 3 8.40 ± 0.05 T9 3 3 2 1 11.29 ± 0.01 k1 10.34 24.96 17.82 25.90 k2 26.07 24.32 22.59 25.70 k3 34.66 21.79 30.66 19.47 R 24.32 3.17 12.84 6.43 表 4 肉牛瘤胃食糜肽氮含量测定方法方差分析表Table 4. Analysis of variance concerning the peptide nitrogen contents in beef cattle rumen digesta变异因子 Variation factor 平方和 Sum of squares 自由度 Degrees of freedom 均方 Mean square F P A 102.01 1 102.01 185.72 < 0.001 B 8.24 1 8.24 14.99 0.02 C 45.81 1 45.81 83.39 0.001 D 6.90 1 6.90 12.56 0.02 SEM 2.20 4 0.55 总和Total 140.28 8 2.2 皱胃食糜内肽氮含量及极差分析
本研究条件下测得的牛皱胃食糜肽氮的最大值为19.28 mg·g–1，最小值为3.75 mg·g–1 (表5)。最优条件为T7：Tris-HCl缓冲液浓度0.06 mol·L–1、Tris-HCl缓冲液pH 6.8、料液比1∶25、浸提时间60 min。各因素对肽氮测定结果均有显著影响，影响程度表现为A > C > B > D，即对Tris-HCl浸提法影响最明显的因素是Tris-HCl缓冲液浓度和料液比(P < 0.05)，Tris-HCl缓冲液pH和浸提时间对Tris-HCl浸提法影响较小(P > 0.05) (表6)。
表 5 肉牛皱胃食糜肽氮测定条件优化正交试验结果Table 5. Orthogonal test results for the determination of the peptide nitrogen contents in beef cattle abomasal digesta处理 Treatment A B C D 肽氮 Peptide nitrogen/(mg·g–1) T1 1 1 1 1 3.75 ± 0.18 T2 1 2 2 2 5.11 ± 0.12 T3 1 3 3 3 5.59 ± 0.13 T4 2 1 2 3 8.45 ± 0.22 T5 2 2 3 1 13.15 ± 0.13 T6 2 3 1 2 8.29 ± 0.08 T7 3 1 3 2 19.28 ± 0.21 T8 3 2 1 3 12.23 ± 0.29 T9 3 3 2 1 11.62 ± 0.19 k1 14.45 31.48 24.27 28.52 k2 29.89 30.49 25.18 32.68 k3 43.13 25.50 38.02 26.27 R 28.68 5.98 13.75 6.41 表 6 肉牛皱胃食糜肽氮含量测定方法方差分析Table 6. Analysis of variance concerning the peptide nitrogen contents in beef cattle abomasal digesta变异因子 Variation factor 平方和 Sum of squares 自由度 Degrees of freedom 均方 Mean square F P A 142.26 1 142.26 56.29 0.001 B 18.41 1 18.41 7.28 > 0.05 C 55.17 1 55.17 21.83 < 0.01 D 0.84 1 0.84 0.33 > 0.05 SEM 10.11 4 2.53 总和Total 190.76 8 3. 讨论
反刍动物吸收肽的途径有两种，肠系膜系统和非肠系膜系统。空肠、回肠、盲肠和结肠为肠系膜系统，瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和十二指肠为非肠系膜系统，其中非肠系膜系统是肽吸收的主要途径，游离氨基酸则主要在肠道中被吸收[12]。有研究表明，瓣胃氨基酸、肽、可溶性蛋白的平均流量均大于瘤胃中的，而且肽形式的氮占了可溶性氮的最大部分[13]，肽的完整吸收与胃肠道肽浓度密切相关。本研究中测得肉牛肽氮含量最大值为14.97 mg·g–1(瘤胃食糜)和19.28 mg·g–1(皱胃食糜)，这与前人理论相符。此外，石慧和梁运祥[4]用差量法测定发酵豆粕中肽氮含量为412 mg·g–1，远高于牛胃内食糜肽氮含量；敖维平等[14]测得高温灭菌棉粕中肽氮含量为2.24 mg·g–1，低于食糜内的肽氮含量。食物进入胃肠道各部位后，在胃肠道中食糜肽氮的含量有一定差异[15]，不同的蛋白质饲料对瘤胃发酵及微生物蛋白质合成效率会有影响[16]，一般采食动物性蛋白、豆饼形成的肽类含量高，而植物性蛋白质饲料及氨基酸平衡较差的蛋白质，则以游离氨基酸为主[3]。在高蛋白水平饲喂下，瘤胃液内肽含量也会升高。此外，本研究表明，Tris-HCl缓冲液浓度对氮的浸提效果有较大的影响，当缓冲液浓度增加时，对氮的浸提效果也增强。这与邓丽莉等[17]研究缓冲液浓度对苹果(Malus domestica)果肉可溶性蛋白提取效率的结果一致，其原因可能是随着Tris-HCl缓冲液浓度的增加，Tris-HCl缓冲液与对食糜的浸提作用增强。本研究表明，在瘤胃食糜中缓冲液pH对氮的浸提有影响，可能是由于蛋白质本身带有电荷，当缓冲液pH发生变化时，有的蛋白质会发生等电点沉淀，进而对肽氮含量的测定结果产生影响，但本研究显示，在皱胃食糜缓冲液pH对氮的浸提有影响，其原因可能是瘤胃食糜和皱胃食糜之间的pH之间有差异，导致不同pH的缓冲液对肽氮测定结果有不同的影响；本研究表明，瘤胃和皱胃食糜中料液比对氮浸提有影响，经方差分析，料液比为1∶25时，氮的浸提效果最佳，其原因可能是随着料液比增加，食糜与浸提液的接触表面积增大，料液浓度变大，浸出食糜内的含氮物质更多。这与邓丽莉等[17]研究料液比对苹果果肉可溶性蛋白提取效率的影响结果一致。本研究表明，在瘤胃食糜中浸提时间对氮浸提有影响，当浸提时间较短时，含氮物质还不能完全被浸提出，随着时间的延长，浸提完全时，浸提效果不再改变[18]。李淑萍等[19]研究的浸提时间对蚂蚁蛋白质的浸提有影响，这与本研究结果一致。但本研究结果亦显示，在皱胃食糜中浸提时间对氮浸提没有影响。反刍动物瘤胃发酵是依靠瘤胃微生物对饲料进行复杂的发酵，饲料经瘤胃微生物的降解后生成小肽、氨基酸或氨氮等[20]，瘤胃微生物在氮源物质转化利用过程中发挥着重要的作用，反当动物瘤胃内存在的原虫对细菌的吞噬作用对微生物氮循环亦产生影响，因此可能会导致瘤胃与皱胃食糜中浸提时间对氮浸提的影响不一致。
肽是蛋白质降解成游离氨基酸的中间产物[21]，在牛胃肠道中肽的吸收代谢非常复杂[22]，饲料蛋白在经过瘤胃时，会由于瘤胃微生物的作用而过多地降解，使得氨基酸成分在到达皱胃之前即被分解，产生过量的氨，造成饲料蛋白的浪费，当以小肽形式作为氮源时，整体蛋白质沉积高于相应游离氨基酸日粮和完整蛋白日粮[23]。有学者提出，为提高饲料蛋白的利用效率，降低瘤胃内肽降解的速度，使得肽能够过瘤胃而不被降解[24]。近年来，对于反刍动物消化道对肽的吸收利用规律以及肽对瘤胃微生物的重要作用等研究也愈来愈深入广泛的展开，而肽氮含量的测定是所有研究中的基础与前提，目前国内关于反刍动物食糜内肽氮含量的测定方法还较少，故本研究使用差量法测定牛胃食糜的肽氮含量，丰富反刍动物食糜内肽氮含量的测定方法。
4. 结论
本研究以Tris-HCl缓冲液浓度、pH、料液比、浸提时间为因素设置了正交试验，各因素对食糜内肽氮测定影响程度表现为Tris-HCl缓冲液浓度 > 料液比 > Tris-HCl缓冲液pH > 浸提时间，利用Design-Expert软件进行了综合分析，确定其反刍动物食糜氮素分离的最优条件为Tris-HCl缓冲液浓度0.06 mol·L–1、Tris-HCl缓冲液pH 6.8、料液比1∶25、浸提时间60 min，继而结合TCA沉淀大分子蛋白、氨基酸态氮比色技术，可测定牛胃食糜肽氮含量。本研究可为反刍动物食糜内肽氮含量的测定方法提供数据支撑。
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表 1 试验因素水平设计
Table 1 Experimental design of the different factors
水平 Level A B C D 1 0.02 6.8 1∶15 40 2 0.04 7.4 1∶20 60 3 0.06 8.0 1∶25 80 A，缓冲液浓度(mol·L–1)；B，缓冲液pH；C，料液比；D，浸提时间(min)；下同。
A, Tris-HCl buffer concentration (mol·L–1); B, Tris-HCl buffer pH; C, ratio of dry digesta to Tris-HCl buffer; and D, extraction time (min); similarly for the following tables and figures.
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表 2 本试验相关因素正交试验设计表
Table 2 Orthogonal experimental design of the related factors
处理 Treatment A B C D T1 1 1 1 1 T2 1 2 2 2 T3 1 3 3 3 T4 2 1 2 3 T5 2 2 3 1 T6 2 3 1 2 T7 3 1 3 2 T8 3 2 1 3 T9 3 3 2 1
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表 3 肉牛瘤胃食糜肽氮正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results for the determination of the peptide nitrogen contents in beef cattle rumen digesta
处理 Treatment A B C D 肽氮Peptide nitrogen/(mg·g–1) T1 1 1 1 1 2.65 ± 0.05 T2 1 2 2 2 3.96 ± 0.14 T3 1 3 3 3 3.73 ± 0.11 T4 2 1 2 3 7.34 ± 0.25 T5 2 2 3 1 11.96 ± 0.29 T6 2 3 1 2 6.77 ± 0.25 T7 3 1 3 2 14.97 ± 0.05 T8 3 2 1 3 8.40 ± 0.05 T9 3 3 2 1 11.29 ± 0.01 k1 10.34 24.96 17.82 25.90 k2 26.07 24.32 22.59 25.70 k3 34.66 21.79 30.66 19.47 R 24.32 3.17 12.84 6.43
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表 4 肉牛瘤胃食糜肽氮含量测定方法方差分析表
Table 4 Analysis of variance concerning the peptide nitrogen contents in beef cattle rumen digesta
变异因子 Variation factor 平方和 Sum of squares 自由度 Degrees of freedom 均方 Mean square F P A 102.01 1 102.01 185.72 < 0.001 B 8.24 1 8.24 14.99 0.02 C 45.81 1 45.81 83.39 0.001 D 6.90 1 6.90 12.56 0.02 SEM 2.20 4 0.55 总和Total 140.28 8
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表 5 肉牛皱胃食糜肽氮测定条件优化正交试验结果
Table 5 Orthogonal test results for the determination of the peptide nitrogen contents in beef cattle abomasal digesta
处理 Treatment A B C D 肽氮 Peptide nitrogen/(mg·g–1) T1 1 1 1 1 3.75 ± 0.18 T2 1 2 2 2 5.11 ± 0.12 T3 1 3 3 3 5.59 ± 0.13 T4 2 1 2 3 8.45 ± 0.22 T5 2 2 3 1 13.15 ± 0.13 T6 2 3 1 2 8.29 ± 0.08 T7 3 1 3 2 19.28 ± 0.21 T8 3 2 1 3 12.23 ± 0.29 T9 3 3 2 1 11.62 ± 0.19 k1 14.45 31.48 24.27 28.52 k2 29.89 30.49 25.18 32.68 k3 43.13 25.50 38.02 26.27 R 28.68 5.98 13.75 6.41
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表 6 肉牛皱胃食糜肽氮含量测定方法方差分析
Table 6 Analysis of variance concerning the peptide nitrogen contents in beef cattle abomasal digesta
变异因子 Variation factor 平方和 Sum of squares 自由度 Degrees of freedom 均方 Mean square F P A 142.26 1 142.26 56.29 0.001 B 18.41 1 18.41 7.28 > 0.05 C 55.17 1 55.17 21.83 < 0.01 D 0.84 1 0.84 0.33 > 0.05 SEM 10.11 4 2.53 总和Total 190.76 8
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