引用本文
李长慧, 李淑娟, 刘艳霞, 董添财, 贾科, 梁德飞. 低温胁迫对10份鹅观草属野生种质抗寒生理指标的影响. 草业科学, 2018,35(1): 123-132
Li Chang-hui, Li Shu-juan, Liu Yan-xia, Dong Tian-cai, Jia Ke, Liang De-fei. Effect of low temperature stress on the cold-resistance physiological indexes of 10 germplasm resources of Roegneria in Qinghai . Pratacultural Science, 2018,35(1): 123-132.  
Doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0391
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低温胁迫对10份鹅观草属野生种质抗寒生理指标的影响
李长慧1, 李淑娟1, 刘艳霞2, 董添财1, 贾科1, 梁德飞1
1.青海大学农牧学院,青海 西宁 810016
2.西藏自治区山南市琼结县农牧综合服务中心,西藏 山南 856800
通讯作者：李淑娟(1967-),女,青海贵德人,教授,硕士,主要从事牧草遗传育种研究。E-mail:lsjqhu@163.com

第一作者:李长慧(1969-),男,山东齐河人,教授,博士,主要从事牧草饲料资源与利用研究。E-mail:746886595@qq.com

收稿日期: 2017-07-18 接受日期: 2017-12-01
资助项目: 青海省科技厅基础研究项目(2014-ZJ-712)和国家自然科学基金(31360578)
摘要

为研究低温胁迫对鹅观草属( Roegneria)野生种质抗寒相关生理指标的影响,以采集自青海三江源区的鹅观草属6个野生种10个居群的植物为研究材料,测定其幼苗在-25~5 ℃低温胁迫下叶绿素(Chl)、可溶性糖(SS)、丙二醛(MDA)和游离脯氨酸(Pro)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性以及细胞膜透性的变化。结果表明,低温胁迫下供试材料细胞膜透性、Chl含量、MDA含量、SS含量、Pro含量以及CAT、POD活性等抗寒生理指标均有显著变化,不同材料间变化幅度不同,并呈现出不同的变化规律,电解质渗出率持续增加,增加幅度为“小-大-小”的“S”曲线;MDA含量先是所有材料一致逐步提高,后是部分材料降低;CAT活性、POD活性、SS含量和Pro含量变化呈现先增加再降低的倒“V”型;9种供试材料的Chl含量持续降低;应用隶属函数法综合评价鹅观草属各材料的抗寒性能,抗寒性由强到弱顺序为玉树鹅观草( Roegneria yushuensis)(玛多) >玉树鹅观草( Roegneria yushuensis)(铁卜加) >玉树鹅观草( Roegneria yushuensis)(兴海) >肃草( R. stricta)(同仁) >曲芒异芒草( R. abolinii var. divaricans)(湟源) >曲芒异芒草( R. abolinii var. divaricans)(泽库)>短柄鹅观草( R. brevipes)(曲麻莱) >紫穗鹅观草( R. purpurascens)(麦秀林场) >短柄鹅观草( R. brevipes)(泽库) >毛穗鹅观草( R. trichospicula)(泽库)。

关键词: 鹅观草属; 低温胁迫; 生理指标; 抗寒性; 隶属函数法; 三江源; 种质资源
中图分类号:S543+.203.4;Q945.7 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2018)01-0123-10
Effect of low temperature stress on the cold-resistance physiological indexes of 10 germplasm resources of Roegneria in Qinghai
Li Chang-hui1, Li Shu-juan1, Liu Yan-xia2, Dong Tian-cai1, Jia Ke1, Liang De-fei1
1.Agriculture and Animal Husbandry Collage of Qinghai University, Xining 810016, Qinghai, China
2.Agriculture and Animal husbandry comprehensive service center of Qiongjie county, Shannan 856800, Tibet, China
Corresponding author: Li Shu-juan E-mail:lsjqhu@163.com
Abstract

In order to study the effect of low temperature on the physiological indexes of 10 populations of six wild species belonging to the Roegneria genus in the Three Rivers region of Qinghai, seedlings with four to five leaf stages were used as experimental materials, and the leaf chlorophyll (Chl), soluble sugar (SS), malondialdehyde (MDA) , free proline (Pro) , catalase (CAT) and peroxidase (POD) activities, and cell membrane permeability were measured under low temperature stress of between -25 and 5 ℃. The results showed that the cold resistance indexes of plant materials, such as Chl content, MDA, SS content, Pro content, and CAT and POD activity were significantly different under low temperature stress compared to the control. Different materials have different change ranges, and present different change rules, that is electrolyte permeability continues increasing by increasing the size of the S curve. The MDA content of the all experimental materials tended to remain consistent first increase, and then decrease. The contents of SS and Pro presented as an inverted V-shape, increasing first and then decreasing. The Chl content of nine materials continued to decrease. Membership function analysis showed the order of cold resistance of the 10 Roegneria germplasms is: Roegneria yushuensis (Maduo) > R. yushuensis (Tiebujia) > R. yushuensis (Xinhai) > R. stricta (Tongren) > R. abolinii var. divaricans(Huangyuan) > R. abolinii var. divaricans (Zeku) > R. brevipes (Qumalai) > R. purpurascens (Maixiu ) > R. brevipes (Zeku) > R. trichospicula (Zeku), in order from the strongest to weakest.

Key words: Roegneria; cold stress; physiological index; cold resistance; method of membership function; Three Rivers region; germplasm resources

鹅观草属(Roegneria)是禾本科小麦族近缘属中植物种类最多的多年生大属。现知全世界有4组20系126种, 分布在北半球的温带、寒带, 我国有4组18系79种, 主要分布在西北、西南、华北和东北等地区[1]。青海省分布的鹅观草属有26种[2], 其中多数种主要分布于海拔3 300~4 500 m的三江源地区, 具有适口性好, 抗逆性强等优良特性, 是高寒地区天然草地的重要组成成分和优良的牧草[3]。三江源区独特的生态区域和极端的气候条件塑造了该区鹅观草属野生草种可以在极端寒冷、干旱和缺氧环境条件的生存特性, 但原始生境不同的植物在低温胁迫下的生理变化是有差异的, 其抗寒性有强弱之分[4, 5]。对牧草抗寒性生理研究是种质资源评价的重要内容之一。植物叶片中的叶绿素(Chl)含量, 可溶性糖(SS)含量和质膜透性以及一些氧化酶均与抗寒性有关[6, 7, 8, 9, 10]。低温胁迫对植物细胞膜透性、Chl含量以及光合作用等生理活动产生不利影响[6, 9, 11, 12], 同时植物在生理生化方面对低温会产生适应变化。例如, 有些植物叶片产生较多的脱落酸, 抑制茎的伸长; 植物中可溶性糖等保护物质增多, 酶的活性发生变化[6, 12]。本研究通过对低温胁迫下鹅观草属10份材料的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性变化、游离脯氨酸(Pro)累积、Chl和丙二醛(MDA)含量及质膜相对透性等生理生化指标变化的研究, 探讨和评价其抗寒性, 旨为抗寒种质筛选和优良草品种选育提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料及处理

2014年自三江源区及其周边地区采集到鹅观草属植物标本200余份, 经过中科院西北生物研究所标本馆鉴定后, 于2015年5月种植在青海大学牧草试验站。选择玉树鹅观草等为试验材料(表1), 待供试材料在田间生长至具有4~5片真叶时, 采集功能叶片装入保鲜袋带回实验室, 在低温冰箱中进行人工模拟降温处理, 处理温度分别为5、0、-5、-10、-15、-20、-25 ℃。低温胁迫24 h测定 CAT和POD活性, Pro、MDA和SS含量以及细胞膜透性等生理生化指标。

表1 供试材料来源 Table 1 Origin of the experiment materials
1.2 测定指标和测定方法

细胞膜透性的测定采用电导法; Chl含量的测定采用荧光法; MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法; SS含量的测定采用蒽酮比色法; Pro含量测定采用磺基水杨酸法; CAT活性的测定采用高锰酸钾滴定法; POD活性的测定采用愈创木酚法[13]。

1.3 抗寒性综合评价方法

用隶属函数法综合各项指标进行抗寒性评价[14]。抗寒性负相关的参数, 相对电导率、MDA采用降型分布函数:U(xi) =(Ximax-Xij)/(Ximax-Ximin); 与抗寒性呈正相关的参数, 脯氨酸、可溶性糖、过氧化氢酶采用升型分布函数:U(xi)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin), 其中U(xi)表示各指标的隶属度值, Xij表示各指标值, Ximax和Ximin分别表示第i项指标的最大值和最小值。

1.4 数据处理

应用SPSS 20.0对同种材料不同温度处理间进行方差分析和差异显著性检验, 应用Excel 2007制作图表。

2 结果与分析
2.1 低温胁迫对细胞膜透性的影响

植物受到低温胁迫后细胞膜的结构遭受破坏, 膜的破坏程度可以通过细胞内电解质外渗率的大小即电导率(Cond)来反映[4]。电导率相对越大说明植物体细胞破坏越严重, 抗寒性就越弱[4]。随着温度的降低, 10份鹅观草属植物材料的细胞膜透性总体呈上升趋势(图1), 其中玉树鹅观草A(玛多)、玉树鹅观草B(铁卜加)、玉树鹅观草E(兴海)、短柄鹅观草F(曲麻莱)、肃草H(泽库西铺沙)的上升比较平缓, 而曲芒异芒草C(湟源)和曲芒异芒草G(泽库)的上升幅度较大; 由5 ℃降低到0 ℃时, 电导率的变化幅度普遍较小; 由0 ℃降低到-5 ℃时, B、C、D、G、H、J电导率增加显著(P< 0.05); 由-5 ℃降低到-15 ℃时, 除I外各材料的电导率增加的幅度相对降低, 但A、B、C、D、E、F、I电导率增加仍显著; 由-15 ℃降低到-20 ℃时, F、H、I、J的电导率增加的变化不显著(P> 0.05); 由-20 ℃降低到-25 ℃时, 大多数材料电导率增加幅度较小, B、C、F、H、I、J的变化差异不显著。总体来看, 同种材料不同温度间电解质渗出率的增加幅度呈现出“ 小-大-小” 的规律, 其中, A、B、E、F、H的电解质渗出率增加幅度较小, 植物细胞膜受损较小; C、G电解质渗出率增加幅度最大, 植物细胞膜受损最大, 说明曲芒异芒草C(湟源)和曲芒异芒草G(泽库)的抗寒性较弱, 玉树鹅观草A(玛多)、玉树鹅观草B(铁卜加)的抗寒性强。鹅观草电解质渗出率随低温胁迫加强呈现出持续增加的规律与银边扶芳藤(Euonymus fortunei)低温胁迫[15]和对30份老芒麦(Elymus sibiricus)种质材料抗寒性[16]研究结果一致。与张尚雄等[17]对3种垂穗披碱草(Elymus nutans)的研究结果有所不同, 在其试验中, 温度降低到10 ℃后, 电解质渗出率不再增加, 而是降低。

图1 低温胁迫对鹅观草幼苗细胞膜透性的影响
A、B、C、……、J表示材料编号, 同表1, 下同。Fig. 1 Effect of cold stress on the relative membrane permeability in leaves of seedlings
A, B, C, ……, J indicate materials code in Table 1; similarly for the following figures.

2.2 低温胁迫对丙二醛含量的影响

MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一, 其含量高则说明低温胁迫下植物受伤害的程度高[18]。 -15~5 ℃范围内, 随着胁迫温度的降低, 鹅观草属植物的MDA含量逐渐增加(图2); 由-15 ℃降到-25 ℃, 不同材料MDA含量变化不一样, A、B、E、F、I是先升高后降低, D、H、J是先降低再升高, C是持续降低, G是持续升高的。总体来看, 短柄鹅观草F(曲麻莱, )在-20 ℃时MDA含量升高到最大值90.25 μ mol· g-1, 说明其遇到低温胁迫后, 调节MDA含量的保护酶系统协同作用弱, MDA含量增加, 使其抗寒作用降低; 曲芒异芒草C(湟源)在低温胁迫过程中, MDA含量增加的幅度最小, 为45.08 μ mol· g-1。6种鹅观草材料随胁迫温度降低, MDA含量先增加后降低的这种规律和张尚雄等[17]对垂穗披碱草低温胁迫的试验结果以及柏晓玲等[19]对燕麦(Avena sativa)幼苗低温胁迫的试验结果一致。

图2 低温胁迫对鹅观草幼苗丙二醛含量的影响Fig. 2 Effect of cold stress on the MDA content in leaves of Roegneria seedlings

2.3 低温胁迫对过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶(CAT)是细胞内重要保护酶, 可以清除逆境条件下细胞内产生的大量自由基, 减轻膜脂过氧化作用, 保护质膜不受自由基的破坏。CAT活性高低间接地说明了植物抗寒性的强弱[6, 12]。低温胁迫由5 ℃降低到-25 ℃, 鹅观草CAT活性呈现先增加再降低的倒“ V” 型(图3)。其中, A、B、D、E、F、H、I的峰值出现在-15 ℃, 其中玉树鹅观草A(玛多)的CAT活性最高, 为79.97 mg· (g· min)-1。说明这几种植物能积累较多的CAT来清除活性氧自由基而表现对逆境的抵抗; C、G、J的峰值出现在-5 ℃, CAT活性较早地开始降低, 表明清除活性氧自由基的能力有限, 表现对逆境抵抗的能力较差; 曲芒异芒草C(湟源)不仅在-5 ℃就开始降低, 而且其峰值仅为62.15 mg· (g· min)-1, CAT活性变化的幅度为12.68 mg· (g· min)-1, 可推断出其抗寒性较弱。韩发等[20]对不同海拔矮嵩草(Kobresia humilis)中CAT活性比较结果为随着海拔的升高, 矮嵩草茎、叶中CAT活性都升高。因此, 可理解为随着海拔升高和气温降低, 矮嵩草CAT活性升高。张志等[21]研究表明, 高羊茅(Festuca elata)在5、0、-6 ℃低温胁迫2、4、6、8 h, CAT活性的变化均为先升高再降低的趋势。

图3 低温胁迫对鹅观草幼苗CAT酶活性的影响Fig. 3 Effect of cold stress on the catalase activity in leaves of Roegneria seedlings

2.4 低温胁迫对过氧化物酶活性的影响

过氧化物酶(POD)主要起到防止H2O2的积累, 避免超氧阴离子和H2O2反应生成毒性更强的羟基自由基, 从而减轻了低温胁迫对植株的伤害[6, 12]。随着温度降低, 植物POD活性逐步升高, 温度降低到-15 ℃左右时, POD活性达到峰值, 然后降低, 呈倒“ V” 字型(图4)。总体来看, 不同植物材料低温胁迫后POD活性的峰值有所不同, 其中, 玉树鹅观草A(玛多)POD活性的峰值最高, 为2 272 U· (g· min)-1, 玉树鹅观草B(铁卜加)POD活性峰值最低, 为1 753 U· (g· min)-1。 H、I、J 的POD活性的峰值较高, C、D、E的POD活性的峰值较低。10种植物材料POD活性均呈现先升后降的变化趋势, 说明这些鹅观草属植物在胁迫前期通过提高POD活性来消除体内产生的自由基, 抵御低温带来的伤害。 在低温胁迫3种披碱草试验中, 在0-18 ℃, 随着温度的降低披碱草POD活性提高[17]。在0-18 ℃间低温胁迫9个野生早熟禾试验中, 叶片POD活性随低温胁迫的加剧而逐渐增大[22]。低温胁迫下, 5种酢浆草属(Oxalis)植物的POD活性随着处理温度的降低呈先上升后下降趋势, 与本研究结果一致[23]。同一物种, 由于分布区海拔不同, 低温胁迫下POD活性有所不同, 如玛多县的玉树鹅观草较铁卜加、兴海县分布的玉树鹅观草POD活性高。泽库分布的曲芒异芒草较湟源县分布的曲芒异芒草POD活性高。

图4 低温胁迫对鹅观草幼苗POD酶活性的影响Fig. 4 Effect of cold stress on the POD activity in leaves of Roegneria seedlings

2.5 低温胁迫下可溶性糖含量变化

可溶性糖(SS)是主要的渗透调节物质, 在植物渗透调节中起着重要作用。植物积累的可溶性糖越多, 低温寒害程度越低。其机理是:植物在低温胁迫后可溶性糖含量增加, 细胞液浓度会提高, 使冰点降低, 减轻细胞的过度脱水, 保护原生质胶体不致遇冷凝固, 从而表现出对低温胁迫的适应性[6, 12]。不同鹅观草材料低温胁迫时均表现出可溶性糖含量随温度的降低而提高, 在-20 ℃时达到峰值, 然后随着温度的降低可溶性糖含量也降低。峰值最大的是玉树鹅观草A(玛多), 峰值最小的是曲芒异芒草C(湟源)(图5)。 对9种野生早熟禾材料低温胁迫试验表明, 在5~-20 ℃范围内, 随温度的降低, 早熟禾SS含量增加[22], 其结果与本研究结果是一致的。

图5 低温胁迫对鹅观草幼苗可溶性糖含量的影响Fig. 5 Effect of cold stress on the soluble sugar content in leaves of Roegneria seedlings

2.6 低温胁迫对游离脯氨酸含量的影响

游离脯氨酸(Pro)是重要的渗透调节物质。当植物遭遇低温时, 细胞内的游离Pro会持续增多, 以降低细胞的渗透势, 从而增强水分保持力, 达到抗寒的目的, Pro的积累是植物对低温胁迫的适应[6, 12]。不同低温胁迫对鹅观草中游离Pro含量有显著的影响(P< 0.05), 随着温度的降低, 10种供试材料中的游离Pro含量均有先升高后降低的趋势(图6)。各供试材料峰值均出现在-15 ℃, 其中玉树鹅观草A(玛多)、短柄鹅观草F(曲麻莱)、短柄鹅观草I(泽库)的峰值较高, 分别为438.79、445.34和422.24 μ mol· g-1; 峰值较低的是毛穗鹅观草D(泽库), 为353.62 μ mol· g-1。同种植物相比较, 玛多的玉树鹅观草(A)低温胁迫下Pro含量的峰值以及Pro含量的Δ 值(不同温度下Pro含量的差值)较铁卜加的(B)和兴海县的(E)高; 曲麻莱得短柄鹅观草(F)低温胁迫下Pro含量的峰值以及Pro含量的Δ 值较泽库的(G)高, 这说明, 分布在海拔高一些的鹅观草在低温胁迫下, 体内Pro含量升高的幅度大一些。这与对不同海拔矮嵩草叶中Pro含量比较研究的结果是一致的[20]。

图6 低温胁迫对鹅观草幼苗叶片游离脯氨酸含量的影响Fig. 6 Effect of cold stress on the free proline content in leaves of Roegneria seedlings

2.7 低温胁迫对叶绿素含量的影响

叶绿素(Chl)的变化直接影响植物的光合作用, 光合作用是主要的代谢活动之一。低温胁迫下会加速植物体内叶绿素的降解, 叶绿素的变化与植物的抗寒性呈负相关[6, 12]。一般情况下, 低温下叶绿素含量较高的植物, 有利于光合作用, 形成可溶性糖等溶质, 对抗寒有利[24]。 随着温度的逐渐降低, 10种供试材料的叶绿素含量逐渐下降(图7), 说明各种鹅观草属材料因持续低温而使叶绿素合成受阻导致叶绿素含量也相对降低。这一结果与已报道的低温胁迫对牧草叶绿素含量影响的结论一致[25, 26, 27]。

图7 低温胁迫对鹅观草幼苗叶绿素含量的影响Fig. 7 Effect of cold stress on the chlorophyll content in leaves of Roegneria seedlings

2.8 抗寒性综合评价

运用隶属函数法对测定的10个供试材料的7项生理指标进行了综合评定, 并做了相关性分析, 可以确定其抗寒性的强弱(表2)。结果表明, 7项指标(Pro含量、SS含量、MAD含量、CAT活性、POD活性、Chl含量以及细胞膜透性)与抗寒综合评价值显著相关(P< 0.01)。抗寒性由强到弱的顺序为玉树鹅观草A(玛多)> 玉树鹅观草B(铁卜加)> 玉树鹅观草E(兴海县)> 肃草H(同仁)> 曲芒异芒草C(湟源)> 曲芒异芒草G(泽库县)> 短柄鹅观草F(曲麻莱)> 紫穗鹅观草J(麦秀林场)> 短柄鹅观草I(泽库)> 毛穗鹅观草D(泽库)。这一结果与铁卜草改试验站试验田及青海大学试验田的种植观察结果基本相一致, 如玉树鹅观草、肃草在铁卜草改试验站试验田及青海大学试验田中返青、长势比曲芒异芒草、紫穗鹅观草、毛穗鹅观草和短柄鹅观草明显好一些, 曲芒异芒草在铁卜加试验田中第2年的返青率较低[4, 5, 8, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30]。

表2 供试鹅观草材料苗期叶片抗寒性各指标隶属函数值、权重及评价值 Table 2 Synthetic evaluation indexes and weighted value of cold resistance character of 10 Roegneria germplasm
3 讨论与结论

高寒地区植物的生长发育经常会受到寒冷胁迫的影响, 抗寒性比较强的植物在长期应对低温等逆境胁迫的过程中形成了功能独特的渗透调节物质和细胞保护酶系[28]。本研究表明, 低温胁迫可诱导鹅观草属植物启动抗寒响应机制, 在生理上产生了一系列的变化, 具体表现:低温胁迫使鹅观草属植物幼苗叶片内积累更多的游离Pro、SS及水分等物质, 这些渗透调节物质的积累可减轻渗透胁迫、降低冰点、增强保水能力、防止膜质和蛋白质的过氧化作用等; CAT、POD是清除活性氧的主要保护酶, 低温胁迫期间CAT可以分解鹅观草属植物体内的过氧化氢, POD可降解过氧化氢, 解除细胞内有害自由基。通过POD和CAT保护酶系统协同作用, 使自由基维持在一个低水平, 从而防止自由基伤害。由于上述渗透调节作用和保护酶系统协同作用, 鹅观草属植物细胞内保护物质增加, 活性氧平衡, 从而具有抗寒性, 能够适应三江源区寒冷的气候。供试材料在不同低温胁迫下, 细胞膜透性、Chl含量、MDA含量、SS含量、Pro含量以及CAT活性、POD活性等生理生化指标均有显著性变化, 不同材料间变化幅度不同, 电解质渗出率的变化呈现持续增加, 增加幅度为“ 小-大-小” 的“ S” 曲线。所有供试材料MDA含量先一致逐步提高, 后部分材料降低; CAT活性、POD活性、SS含量和Pro含量的变化规律呈现先增加再降低的倒“ V” 型; 9种供试材料的Chl含量持续降低; 应用隶属函数法综合评价鹅观草属各材料的抗寒性, 抗寒性由强到弱顺序:玉树鹅观草(玛多)> 玉树鹅观草(铁卜加)> 玉树鹅观草(兴海)> 肃草(同仁)> 曲芒异芒草(湟源)> 曲芒异芒草(泽库)> 短柄鹅观草(曲麻莱)> 紫穗鹅观草(麦秀林场)> 短柄鹅观草(泽库)> 毛穗鹅观草(泽库)。不同海拔分布的同一植物种的抗寒性也有一定差异, 体现出了环境对植物的塑造性。海拔高的地区年均气温较低, 在寒冷地区生长的植物抗寒性较强一些。有研究表明[29, 30, 31], 与气候梯度有关的基因梯度的分布说明寒冷地区的树种更为抗寒。与此类似, 分布地海拔较高的玛多县的玉树鹅观草较分布地海拔较低的铁卜加的玉树鹅观草的抗寒性强。本研究设置的温度范围为-25~5 ℃。检索对高原植物低温胁迫的研究文献, 发现已有研究中设置的温度偏高, 缺乏-25~-15 ℃的低温设置, 所以本研究可对比的文献不多。

(责任编辑 张瑾)

The authors have declared that no competing interests exist.

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