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李晶, 刘锦霞, 李娜, 丁品, 杜文静, 武建荣, 张建军. 黄帚橐吾乙醇提取物对小鼠的急性毒性试验. 草业科学, 2017,34(9):1941-1946
Li Jing, Liu Jin-xia, Li Na, Ding Pin, Du Wen-jing, Wu Jian-rong, Zhang Jian-jun. Toxicity of ethanol extracts from Ligularia virgaurea . Pratacultural Science,2017,34(9): 1941-1946  
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黄帚橐吾乙醇提取物对小鼠的急性毒性试验
李晶, 刘锦霞, 李娜, 丁品, 杜文静, 武建荣, 张建军
甘肃省科学院生物研究所,甘肃 兰州 730000
通信作者：刘锦霞(1974-),女,甘肃庆阳人,高级研究员,本科,主要从事生物农药资源发掘及产品开发。E-mail:liujinx0168@163.com

第一作者:李晶(1983-),女,河南临颍人,助理研究员,硕士,主要从事植物源农药提取及相关开发方面的工作。E-mail:eyre326@163.com

收稿日期: 2017-02-20
基金: 基金项目:甘肃省科技支撑计划(1504JKCA074); 甘肃省科学院应用开发计划(2015-JK-04)
摘要

黄帚橐吾( Ligularia virgaurea)是一种在甘南草原上广泛分布的毒杂草,但同时其乙醇提取物有很强的生物农药活性,具备开发成为生物农药的潜力。本研究通过昆明小鼠( Mus musculus)的经皮、经口急性毒性试验对黄帚橐吾乙醇提取物的安全性进行评估。结果显示,黄帚橐吾乙醇提取物对小鼠的经皮急性毒性半致死剂量LD50>30 g·kg-1,经口急性毒性LD50为6.983 1 g·kg-1,均符合低毒农药登记的毒性标准,可以按照低毒农药进行开发应用。

关键词: 黄帚橐吾; 乙醇提取物; 急性毒性试验; 农药; 经口; 经皮; 昆明小鼠
中图分类号:S452 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2017)09-1941-06 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0476
Toxicity of ethanol extracts from Ligularia virgaurea
Li Jing, Liu Jin-xia, Li Na, Ding Pin, Du Wen-jing, Wu Jian-rong, Zhang Jian-jun
Gansu Provincial Academy of Sciences Institute of Biology, Gansu Lanzhou 730000
Corresponding author: Liu Jin-xia E-mail:liujinx0168@163.com
Abstract

Ligularia virgaurea. is a widespread poisonous plant species growing in Gannan grassland. The ethanol extract of L. virgaurea is known to possess strong bioactivity. To evaluate the safety of ethanol extract from leaves of L. virgaurea, acute toxicity studies were conducted in mice. All of the tests were based on the 《Toxicological Test Methods of Pesticides for Registration》. The results showed that LD50 of the acute dermal toxicity was greater than 30 g·kg-1, while the LD50 of the acute oral toxicity was 6.983 1 g·kg-1. The ethanol extracts from leaves of L. virgaurea belonged to low-toxic compound, which conformed to the standards of low-toxicity pesticide registration. Based on these results, the ethanol extract may have a potential for exploitation and application as a low-toxicity pesticide.

Keyword: Ligularia virgaurea; ethanol extract; acute toxicity; pesticide; percutaneous toxicity; oral toxicity; Mus musculus

我国是最早应用杀虫剂、杀菌剂防治植物病虫害的国家之一[1], 伴随着长期依赖和大量使用有机合成化学农药, 环境污染、生态破坏以及食品安全等一系列问题逐渐被人们所关注[2, 3], 大量研究开始积极研发更加环保、安全的生物农药[4]。其中, 植物源农药凭借其在自然环境中易降解、选择性强、无污染、对人畜安全等特点[5], 已成为生物农药的首选。

黄帚橐吾(Ligularia virgaurea)为菊科橐吾属多年生草本植物, 主要分布于青藏高原东北部、云南西北部、甘肃、青海、四川等高海拔地区, 生长于高寒草地、湿地、沼泽、草甸及灌丛中, 是入侵草地的主要毒杂草[6, 7, 8, 9], 常在草地中形成单优势种群, 危害巨大[10]。近几年黄帚橐吾的开发利用成为研究热点。据报道, 黄帚橐吾茎、叶的甲醇提取物对菜粉蝶幼虫有较强的触杀和拒食作用, 48 h触杀死亡率为83.33%, 48 h拒食率为82.23%[11], 对常见的玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)和水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)也具有明显的抑菌作用, 抑制率分别为90.16%、77.47%[1]。前期研究发现, 黄帚橐吾乙醇提取物能够有效灭杀棉铃虫幼虫, 其对棉铃虫3龄前幼虫有很强的拒食活性, 拒食中浓度(AFC50)为2.59 mg· mL-1; 浓度为10.00 mg· mL-1时, 拒食率超过95%; 触杀和胃毒活性也较强, 半致死剂量(LC50)约为3.00 mg· mL-1; 浓度为10.00 mg· mL-1时, 校正死亡率均超过80%[12]。黄帚橐吾乙醇提取物在防控鳞翅目和同翅目害虫危害方面具有较大的开发价值。上述研究已经证实黄帚橐吾在病虫害防控方面具有较好的开发前景, 可以将这种草原杂草变废为宝, 作为防控农作物虫害的生物农药进行开发应用。生物农药最显著的特性是选择性强、对人畜安全[13], 因此将黄帚橐吾乙醇提取物作为生物农药的主要成分进行开发应用时, 对其安全性进行评价是先决条件, 也是我国《农药管理条例》和《农药管理条例实施办法》中规定的必研项目。现有研究中关于黄帚橐吾乙醇提取物的急性毒性尚未见相关报道, 所以本研究参照《农药登记毒理学试验方法》 (GB15670-1995), 通过小鼠的经皮、经口急性毒性试验对黄帚橐吾乙醇提取物安全性进行初步评估, 以丰富毒理学资料, 为其作为新的植物源农药进行应用开发和新农药登记提供基础依据。

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 试验动物 昆明种健康小鼠(Mus musculus), 雌雄各半, 体重(20± 2) g, 购自甘肃省医学实验动物中心, 合格证号:SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2 受试药物 黄帚橐吾乙醇提取物(黄帚橐吾叶的乙醇浸提物), 有特异气味的深褐色浸膏, 临用前用0.5% 泊洛沙姆超声乳化配制乳浊液或用白凡士林配制成软膏。

1.2 试验方法

1.2.1 黄帚橐吾地上部乙醇提取物的制备 8月中旬在甘南草原采黄帚橐吾的叶片, 水洗除尘, 于110 ℃杀青10 min, 晾干, 粉碎。 将粉碎物与90%乙醇按1∶ 1(g∶ mL)置于加塞的圆底烧瓶中, 常温下浸泡24 h, 45 ℃超声提取40 min, 静置1 h后, 再在相同条件下超声提取第1次, 共进行3次。过滤, 收集滤液; 依上述方法共提取3次, 滤渣再用少量溶剂洗涤3次, 过滤。合并所得所有滤液, 过滤除杂。在0.08 MPa、40 ℃条件下减压旋蒸滤液, 至溶剂不再蒸出, 得到有特异气味的棕黑色浸膏样品[14]。

1.2.2 经皮急性毒性试验 选择体质量18~22 g的小鼠, 每组10只, 雌雄各半, 随机分为3组。给药24 h前将小鼠背部脊柱两侧毛用8.0% 硫化钠水溶液脱掉, 硫化钠涂于动物脊背两侧2 min后, 用纱布沾清水洗净、擦干。小鼠脱毛面积约3 cm× 3 cm。分别以药∶ 凡士林1∶ 10、1∶ 100、1∶ 1 000的剂量比例配制白凡士林软膏。按上述浓度经皮给药, 方法为先将小鼠固定, 在略小于剃毛面积内进行定量敷药, 然后覆盖一个与脱毛面积相当的盒式罩, 再用胶布固定, 以防止小鼠舔食药物(20 mL· kg-1, 每天2~3次, 间隔4 h), 找出受试药物的0和100%的估计致死量。另取小鼠, 每组10只, 雌雄各半, 随机分为6组。脱毛, 以受试药物0和100% 估计致死量为依据, 分别以0估计致死药量的2、4、8、16倍的剂量比例配置白凡士林软膏, 再加上受试药物的0和100%的估计致死量, 共6个浓度经皮给药(20 mL· kg-1, 每天2~3次, 间隔4 h), 测定受试药物的最小剂量(Dmin)和最大剂量(Dmax), 并计算组间剂量比值(K)。

1K=(N+1) DmaxDmin.

以 Dmin 作为最低剂量组, 以 Dmax 作为最高剂量组, 按K值计算出中间剂量。按照计算结果将药物配为6个浓度, 另取小鼠, 每组10只, 雌雄各半, 随机分为7组, 经皮给药后观察并详细记录动物的反应情况以及动物死亡分布结果, 对照组经皮给药100%凡士林, 其余操作同处理组。给药后小鼠饲养环境不变, 温度21~25 ℃, 相对湿度60%~70%, 光照12 h明暗变换。

若无法测得Dmax 或小鼠均无死亡, 另取小鼠20只, 雌雄各半, 随机分为两组, 给药前24 h将小鼠背部脊柱两侧毛用8.0%硫化钠水溶液脱掉, 小鼠脱毛面积约3 cm× 3 cm。分别以(受试药物∶ 白凡士林1∶ 1)配制白凡士林软膏, 经皮给药(20 mL· kg-1, 分3次, 间隔6 h)测定最大耐受剂量(MTD), 并观察各小鼠的饮食、活动、精神状态、皮毛肤色、大小便、体重变化及死亡情况, 连续观察14 d, 试验设对照组, 经皮给药100%凡士林, 其余操作同处理组。

1.2.3 经口急性毒性试验 选择体重(20± 2) g的小鼠, 随机分组, 每组10只, 雌雄各半, 随机分为3组。试验前动物禁食不禁水12 h, 将黄帚橐吾提取物分别以药∶ 0.5%泊洛沙姆1∶ 10、1∶ 100、1∶ 1 000的比例配制乳浊液, 灌胃给药(20 mL· kg-1), 找出受试药物的0和100% 的估计致死量。另取小鼠, 以0估计致死药量的2、4、8、16倍比例配置乳浊液, 灌胃给药(20 mL· kg-1)。根据Dmin和Dmax 以及计划分组数计算K值, 并计算中间几组剂量。按照计算结果将药物配为6个浓度, 另取小鼠, 每组10只, 雌雄各半, 随机分为7组, 灌胃给药(20 mL· kg-1)后观察并详细记录动物的反应情况以及动物死亡分布结果, 对照以0.5%泊洛沙姆生理盐水乳浊液灌胃, 其余操作同处理组。

1.2.4 一般体征观察及急性毒性评估 经皮给药、经口给药后严密观察并记录24 h内动物的反应情况, 并连续观察14 d, 期间重点观察小鼠神经系统、呼吸系统、心血管系统、消化系统以及皮毛等的反应情况[15], 总结数据, 做出急性毒性评估。

1.3 数据分析处理

采用SPSS 22.0中机率单位加权回归法(Bliss)计算黄帚橐吾提取物对小鼠急性毒性的LD50 以及 95% 置信区间。

2 结果与分析
2.1 经皮急性毒性测定

受试药物经皮给药后无法测得LD50, 按照最高浓度(50%)单次最大给药容量(20 mL· kg-1)给药, 持续观察14 d, 未见动物死亡。对照组小鼠未见明显异常(表1)。按照单次最大给药容量推测经皮 LD50> 30.0 g· kg-1, 即经皮急性毒性(MTD)为30.0 g· kg-1。参照我国现行农药经皮急性毒性分级标准, 经皮LD50> 2.0 g· kg-1时属低毒农药, 因此, 黄帚橐吾提取物经皮毒性属低毒。

表1 黄帚橐吾提取物对小鼠的经皮急性毒性(MTD)测定结果 Table 1 The results of maximum tolerated dose (MTD) of the acute percutaneous toxicity of extracts from Ligularia virgaurea in Mus musculus
2.2 经口急性毒性LD50测定

预试验结果显示, 黄帚橐吾叶提取物的Dmax为15.0 g· kg-1, Dmin 为 5.0 g· kg-1, K为0.75, 设6个剂量组进行正式试验(表2)。上述数据经SPSS 22.0中的机率单位加权回归法(Bliss)分析计算, 得到概率单位值P; 回归方程为Y=0.834 4+4.935 3X, a=0.01时查得r为0.917 0, 式中:Y为概率单位加5后的值, X为剂量的对数; 最终得到LD50为6.983 1 g· kg-1, 95%置信区间为5.302 3-9.196 7。参照我国急性经口毒性分级标准, 当LD50> 500 mg· kg-1时, 属于低毒毒性, 因此, 黄帚橐吾提取物经口毒性属低毒。

表2 黄帚橐吾提取物对小鼠经口 LD50测定结果 Table 2 The results of LD50 of the acute oral toxicity of extracts from Ligularia virgaurea in Mus musculus
2.3 经皮急性毒性评价

受试药物经皮给药后无法测得 LD50, 按照最高浓度(50%)单次最大给药容量(20 mL· kg-1)给药后, 10 min左右小鼠出现兴奋、不安、躁动、跳跃、震颤等症状, 60 min后开始减轻, 90 min出现镇静、蜷缩, 活动量明显减少, 180 min饮食、活动恢复正常, 大小便未见异常, 体重增加正常, 持续观察14 d, 未见动物死亡。对照组小鼠未见明显异常(表1)。

2.4 经口急性毒性评价

受试药物灌胃给药后, 中毒小鼠在30 min内出现蜷缩、张口、弓背、运动平衡失调、四肢僵硬, 最后抽搐死亡。解剖后肉眼观察, 未见肺、肝、肾、脑、心脏的形态和颜色异常。生存小鼠在给药15 min后开始进水进食, 活动正常, 粪便性状正常, 体重增加正常, 对照组小鼠未见明显异常。

3 讨论

黄帚橐吾提取物作为潜在的植物源农药其作用已经被大量研究证明[12, 16], 但未见关于其安全性评价的相关研究资料。急性毒性试验是农药安全性评价的第一步[17, 18], 也是安全性评价的基础[19, 20], 决定了新农药的开发前景, 也是农业管理部门制定农药危害的防治对策和卫生标准的依据[21]。

本研究按照《农药安全性评价程序》以及《农药登记毒理学试验方法》(GB 15670-1995)对黄帚橐吾的乙醇提取物进行了初步的毒性试验。黄帚橐吾乙醇提取物对小鼠的经皮急性毒性损害推测主要为皮肤直接刺激和神经系统功能紊乱, 按照单次最大给药容量得出经皮LD50> 30.0 g· kg-1, 即 MTD 为30.0 g· kg-1, 此阈值比另外一种人畜低毒农药3%甲氨基阿维菌素微乳剂(其LD50> 2.0 g· kg-1[22])都要低得多, 说明黄帚橐吾提取物的经皮安全性更高。其LD50大于实际无毒剂量(15 g· kg-1), 属实际无毒物质[23]。经口试验结果表明, 其主要中毒靶器官为植物神经系统, 以运动系统为主, 中毒起效快, 持续时间较短。其LD50为6.983 1 g· kg-1, 远低于其它几种已商品化的低毒农药(天然除虫菊酯LD50为900 mg· kg-1[24], 鱼藤酮LD50为34.1 mg· kg-1[25]), 说明黄帚橐吾提取物的经口安全性也较高。

结合资料[5, 6, 7]以及前期杀虫农药活性试验[12]的结果得出, 黄帚橐吾的乙醇提取物对鳞翅目和同翅目害虫的防效可以达到80%, 作为新农药开发的先决条件, 本研究通过小鼠急性经皮、经口试验对黄帚橐吾乙醇提取物的安全性进行了评价, 黄帚橐吾乙醇提取物完全符合低毒农药登记的毒性标准, 可以按照低毒农药进行开发应用。这为其后续开发提供了完善、可靠的依据, 为后期需要进行的亚慢性、慢性和其它毒性试验的剂量水平提供了基础试验数据和参考。经皮、经口急性毒性试验是农药安全性评价试验的起始步骤[26], 其试验结果有效但不能直接推及至人类, 关于其对人、畜的精确安全阈值, 还需要综合其它毒理学试验进行进一步验证和全面评价。

The authors have declared that no competing interests exist.

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