巨菌草(Pennisetum sp.)由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供, 挑选处于68个月生长期的巨菌草, 于2014年10月18日进行人工收割。

添加剂为纤维素酶(cellulase, CEL)、木聚糖酶(xylanase, XYL)以及绿汁发酵液(fermented green juice, FGJ)。

纤维素酶与木聚糖酶均购自广东溢多利公司, 其酶活分别为20 000和100 000 U· g^-1。将纤维素酶和木聚糖酶分别配制成5%和2.5%水溶液备用(使用前用滤纸过滤)。

绿汁发酵液的制备:使用青贮原料巨菌草。将新鲜的巨菌草切碎、混合均匀, 称取200 g加入少量蒸馏水、榨汁, 用双层纱布过滤, 添加2%蔗糖, 混匀后定容至1 000 mL, 转入发酵瓶中, 30 ℃恒温厌氧发酵48 h备用。

本研究设计两个试验组合。第1个试验组合设对照组、添加1 000 U· kg^-1的纤维素酶组、添加2 mL· kg^-1的绿汁发酵液组和添加1 000 U· kg^-1纤维素酶+ 2 mL· kg^-1绿汁发酵液(复合1)组; 第2个试验组合设对照组、添加1 250 U· kg^-1的木聚糖酶组、添加2 mL· kg^-1的绿汁发酵液组和添加1 250 U· kg^-1木聚糖酶+2 mL· kg^-1绿汁发酵液(复合2)组。添加剂的添加水平是按新鲜原料的质量进行计算。每个处理3个重复。

青贮调制于2014年10月19日开始进行。将巨菌草用切草机切碎至约2 cm长, 每个处理组均称取400 g, 装入塑料袋内, 按试验设计方案各个处理组加入添加剂混匀后大致分为3等份, 分装进标有相应标签的青贮袋内, 抽气、封口、称重。室温条件下贮存60 d后开封, 供分析测定。

将巨菌草原料和青贮的风干样本置于干燥箱65 ℃条件下干燥48 h, 待冷却回潮后用粉碎机粉碎, 装袋后待测定指标。干物质(DM)和粗蛋白质(CP)含量的测定参照常规法^[17], 中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量的测定参照van Soest方法^[18], 半纤维素(HC)=中性洗涤纤维-酸性洗涤纤维。可溶性碳水化合物(WSC)含量采用比色法^[18]测定。

在100 mL的广口锥形瓶中, 装入20 g青贮样品, 加蒸馏水定容至100 mL, 用保鲜膜封口, 置于4 ℃冰箱中24 h后取出用滤纸过滤, 所得滤液即为青贮饲料浸提液。用pH计测定浸提液的pH; 用岛津LC-20 AT型高效液相色谱仪(色谱柱:Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 300× 8 mm, 检测器:SPD-M10AVp, 流动相:3 mmol· L^-1高氯酸)分析青贮浸提液中乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量^[19]; 用苯酚-次氯酸钠比色法^[20]测定青贮饲料浸提液的氨态氮(AN)。

干物质回收率=[(开封时回收青贮重× 青贮干物质含量)/(装填时装入原料重× 原料干物质含量)]× 100%;

气体损失率=[(装填时装入原料重-开封时回收青贮重)/(装填时装入原料重× 原料干物质含量)]× 100%。

原始数据用Excel 2003初步整理后, 用SPSS 17.0统计软件分别对不同添加剂处理组进行单因素方差分析, 并用Duncan法对各测定数据进行多重比较; 结果用平均数± 标准差表示。

经测定, 巨菌草原料的DM含量为30.47%, 在干物质基础下, WSC含量为9.18%, NDF含量为75.50%, ADF含量为45.6%, HC含量为29.9%, CP含量为6.85%。由此可见, 巨菌草的DM含量在常规青贮原料的范围内, WSC、NDF、ADF、HC以及CP的组成状况与一般禾本科牧草大致相符。

2.2.1 添加纤维素酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮品质的影响 与对照组相比, 纤维素酶组的HC含量极显著(P< 0.01)降低, DMR显著(P< 0.05)升高(表1); 绿汁发酵液组的pH、AA含量、GLR、AN含量极显著降低, BA含量和HC含量显著降低, LA含量、DMR和WSC均显著升高; 复合1组的pH、GLR、AN含量、HC含量极显著降低, LA含量和PA含量分别极显著和显著升高。与纤维素酶组相比, 复合1组的pH以及GLR极显著降低, LA含量、AA含量以及PA含量极显著或显著升高。与绿汁发酵液组相比, 复合1组的LA含量、AA含量、PA含量以及BA含量极显著或显著升高, HC含量显著降低。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 纤维素酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮发酵品质与营养成分的影响 Table 1 Effects of cellulase and fermented green juice on the quality of Pennisetum sp. silage 项目 Item 对照 Control 纤维素酶 Cellulose enzyme 绿汁发酵液 Green juice fermented liquid 复合1 Complex 1 pH 5.24± 0.09A 5.32± 0.07A 3.75± 0.41B 3.98± 0.12B 乳酸LA/% 0.40± 0.01BCc 0.30± 0.05Cc 0.62± 0.09Bb 1.65± 0.16Aa 乙酸AA/% 0.68± 0.14Aab 0.55± 0.05ABb 0.13± 0.19Bc 0.93± 0.18Aa 丙酸PA/% 0.12± 0.01ABb 0.02± 0.04Bb 0.01± 0.02Bb 0.31± 0.13Aa 丁酸BA/% 0.14± 0.02ABa 0.20± 0.05Aa 0.04± 0.05Bb 0.16± 0.06ABa 干物质DM/% 27.19± 0.05 29.12± 1.68 29.04± 0.67 28.01± 1.21 干物质回收率DMR/% 89.87± 0.43b 91.62± 0.79a 91.63± 0.54a 90.39± 0.80ab 气体损失率GLR/% 7.03± 0.61A 7.75± 0.63A 4.90± 0.16B 5.30± 0.52B 氨态氮AN/mg· 100 g-1 87.28± 1.00A 85.65± 2.26A 66.93± 4.75B 67.07± 6.27B 可溶性碳水化合物WSC/% 1.90± 0.16b 1.95± 0.10ab 2.40± 0.17a 2.20± 0.40ab 中性洗涤纤维NDF/% 74.70± 1.39 72.54± 0.66 72.85± 1.98 72.84± 0.10 酸性洗涤纤维ADF/% 49.45± 0.73 49.73± 0.73 49.064± 1.28 50.72± 0.72 半纤维素HC/% 25.25± 0.75Aa 22.81± 0.45Bbc 23.79± 0.84ABb 22.12± 0.62Bc

表1 纤维素酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮发酵品质与营养成分的影响 Table 1 Effects of cellulase and fermented green juice on the quality of Pennisetum sp. silage

注:乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量以新鲜物基础表示, 氨态氮以占100 g青贮的mg表示; 同行不同大写字母表示处理间差异极显著(P< 0.01), 同行不同小写字母表示处理间差异显著(P< 0.05), 无字母表示差异不显著。下同。

Note: The LA, AA, PA and BA were expressed as a fresh material basis. The AN expressed in mg of 100 g silage. Different capital and lowercase letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively; similarly for the following tables.

2.2.2 添加木聚糖酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮品质的影响 与对照组相比, 木聚糖酶组的LA含量、AA含量、PA含量和WSC含量极显著(P< 0.01)或显著(P< 0.05)降低; 绿汁发酵液组的pH、AA含量、PA含量、GLR均极显著降低, BA含量、AN含量均显著降低, DMR和WSC、LA含量极显著和显著升高; 复合2组的pH、AA含量、PA含量均极显著降低, GLR显著降低, LA含量极显著升高。与木聚糖酶组相比, 复合2组的GLR、极显著降低, pH、AA含量和ADF含量显著降低, LA含量极显著升高。与绿汁发酵液组相比, 复合2组的WSC含量、DMR极显著或显著降低, LA含量、AN含量、GLR极显著或显著升高。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 木聚糖酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮发酵品质与营养成分的影响 Table 2 Effects of xylanase and fermented green juice on the quality of Pennisetum sp. silage 项目 Item 对照 Control 木聚糖酶 Cellulose enzyme 绿汁发酵液 Green juice fermented liquid 复合2 Complex 2 pH 5.24± 0.09Aa 5.18± 0.13ABa 3.75± 0.41Bb 4.04± 0.07Bb 乳酸LA/% 0.40± 0.01Bc 0.17± 0.06Cd 0.62± 0.09Bb 0.96± 0.11Aa 乙酸AA/% 0.68± 0.14Aa 0.40± 0.06ABb 0.13± 0.19Bc 0.05± 0.04Bc 丙酸PA/% 0.12± 0.01Aa 0.06± 0.03ABb 0.01± 0.01Bc 0.05± 0.01Bbc 丁酸BA/% 0.14± 0.02a 0.05± 0.05ab 0.04± 0.05b 0.08± 0.07ab 干物质DM/% 27.19± 0.05 27.48± 1.78 29.04± 0.67 29.03± 0.81 干物质回收率 DMR/% 89.87± 0.43Bb 90.58± 0.46ABb 91.63± 0.54Aa 90.38± 0.17ABb 气体损失率GLR/% 7.03± 0.61ABa 7.36± 0.13Aa 4.91± 0.16Cc 6.10± 0.60BCb 氨态氮AN/mg· 100 g-1 87.28± 1.00A 86.82± 1.10A 66.93± 4.75B 83.25± 0.22A 可溶性碳水化合物WSC/% 1.90± 0.16Bb 1.59± 0.05Bc 2.40± 0.17Aa 1.86± 0.13Bb 中性洗涤纤维NDF/% 74.70± 1.39 73.36± 0.24 72.85± 1.98 72.71± 0.67 酸性洗涤纤维ADF/% 49.45± 0.73ab 50.01± 1.20a 49.06± 1.28ab 47.49± 0.84b 半纤维素HC/% 25.25± 0.75 23.35± 1.30 23.79± 0.84 25.22± 1.44

表2 木聚糖酶和绿汁发酵液对巨菌草青贮发酵品质与营养成分的影响 Table 2 Effects of xylanase and fermented green juice on the quality of Pennisetum sp. silage

在调制常规青贮时, 确保乳酸菌旺盛繁殖重要条件是青贮的原料中水分是否适宜。一般牧草青贮时, 原料的含水率以65%~75%为宜^[21], 本研究的巨菌草经过1 d晾晒, 含水率下降到70.5%, 达到适宜水平范围, 琚泽亮等^[22]研究发现, 燕麦(Avena sativa)与箭筈豌豆(Vicia sativa)混合青贮, 含水率为65%70%时青贮效果最佳。然而, 乳酸菌的繁殖活动不仅需要适宜的湿润条件, 还必须含有能够保证乳酸菌充分繁殖的发酵底物。于是, 原料中WSC的含量是决定青贮能否成功的关键条件。本研究青贮原料的WSC含量为9.18%, 稍低于一般牧草青贮原料满足乳酸发酵需要(占干物质10%以上)的水平^[21]。为此, 本研究在利用巨菌草为原料进行青贮时添加入添加剂以促进乳酸发酵, 以期生产高品质青贮饲料。

WSC作为乳酸菌繁殖发酵的底物, 其含量是调制优质青贮饲料的关键因素。原料如果缺少WSC, 则青贮发酵的成功性将大大降低。纤维素酶能有效降解植物细胞壁, 改变其纤维结构, 将原料中的结构性多糖降解为葡萄糖, 以释放出WSC供乳酸发酵所用, 有效提高青贮饲料中的WSC以及DMR, 从而改善青贮饲料的发酵品质和饲用价值^[21]。本研究表明, 与对照组相比, 纤维素酶组的HC含量极显著降低, DMR显著升高, 这一结果与庄益芬等^[23]在灵芝菌糟发酵饲料中添加不同水平纤维素酶能提高饲料的DMR的试验结果一致。

在青贮饲料中添加木聚糖酶能够有效降解植物细胞壁的纤维成分, 释放出WSC, 促进乳酸发酵, 降低pH, 促进乳酸菌的增殖, 抑制其它有害菌的增殖, 提高青贮饲料品质^{[14, 24]}。但是, 在本研究中, 与对照组相比, 木聚糖酶组的LA含量、AA含量、PA含量、WSC含量均极显著或显著降低。分析推测, 木聚糖酶的添加在使巨菌草植物纤维降解而发生化学变化的同时, 其物理结构也发生了一定的变化, 可能青贮原料变得相对较粘, 这样则会阻碍乳酸菌对发酵底物的利用而不能得到更好的繁殖。在本研究对青贮的感官评定中, 木聚糖酶组青贮较对照组及其它处理组粘度稍高。

现今在青贮添加剂的选择方面, 人们愈发倾向于安全环保的生物性添加剂。本研究选用了经济、易得的生物性添加剂, 即绿汁发酵液。绿汁发酵液中富含的乳酸菌能提高原料的乳酸菌数目和种类, 使乳酸菌在青贮过程中始终处于优势状态, 从而加速青贮的乳酸发酵和降低pH, 提高青贮品质^{[13, 25]}。Bureenok等^[26]在大黍(Panicum maximum)青贮中添加绿汁发酵液后能降低青贮饲料的pH 及AN含量, 提高LA含量。荣辉等^[27]在象草(Pennisetum purpureum)青贮中添加绿汁发酵液能使青贮的LA含量减少, AA和BA含量增加, pH升高。本研究在巨菌草青贮中添加绿汁发酵液, 不仅能使pH、GLR、AN含量极显著降低, 还能增加LA含量、提高DMR, 并提高WSC的存留量、减少AA含量。这与很多添加绿汁发酵液进行青贮的试验结果相一致^{[26, 27, 28]}。

青贮原料中足够的WSC和有效乳酸菌数目都是乳酸发酵的必备条件。理论上, 纤维素酶和绿汁发酵液同时添加对改善青贮品质具有协同相乘的效果。张英等^[29]在以王草(Pennisetum purpureum× P. americanum)为原料青贮时, 发现添加绿汁发酵液和纤维素酶复合剂的青贮饲料品质要高于两者单独添加。叶杭等^[30]在以香蕉(Musa nana)茎玉米面粉混合物为原料所进行的青贮试验结果表明, 绿汁发酵液与纤维素酶复合添加时, 所获得的青贮饲料品质高于二者单独添加。可见, 调制青贮时将绿汁发酵液与纤维素酶复合添加, 在确保原料中乳酸菌群占据优势地位的前提条件下, 纤维素酶能把部分植物纤维降解, 释放出能够被乳酸菌利用的糖类, 有利于加快乳酸菌的繁殖。而本研究中纤维素酶与绿汁发酵液复合添加组, 与纤维素酶单独添加组相比, pH和GLR极显著降低, LA、AA和PA含量极显著和显著升高; 与绿汁发酵液单独添加组相比, LA、AA、PA和BA含量极显著和显著升高, HC含量显著降低。表明, 纤维素酶与绿汁发酵液复合添加的效果优于二者单独添加。

本研究中木聚糖酶和绿汁发酵液复合添加组, 在pH、AA、PA以及AN含量上较对照组极显著降低, 在LA含量上极显著升高, 在GLR上显著降低。表明, 利用巨菌草青贮时复合添加木聚糖酶和绿汁发酵液能有效提高巨菌草青贮的品质。特别是在LA含量上, 木聚糖酶和绿汁发酵液复合添加组极显著高于两者的单独添加组。说明在促进LA生成上, 木聚糖酶与绿汁发酵液复合添加获得了相乘效果, 添加效果优于两者单独添加。分析原因, 主要在于绿汁发酵液能够弥补巨菌草中乳酸菌数量的不足, 能高效利用巨菌草中的WSC快速繁殖而生成较多的乳酸, 使青贮饲料的pH快速下降。这也是木聚糖酶与绿汁发酵液复合添加组青贮品质显著优于木聚糖酶组青贮品质的原因所在。陈国富等^[31]将不同水平的木聚糖酶分别与绿汁发酵液复合添加所调制的灵芝菌糟发酵饲料结果表明, 各不同水平复合添加组均能不同程度地降低pH值和增加LA含量。这与本研究的结果一致。