本研究所用种子为地方品种辽宁阜新沙打旺, 种子保存在兰州大学草地农业科技学院种子库中(4 ℃, 黑暗)。

本研究所用病原真菌分离自辽宁阜新沙打旺种子。种带真菌检验参照文献[16]的方法。将种子放在纱网内用自来水冲洗3遍, 再用70%的酒精消毒30 s, 然后用1%的次氯酸钠溶液消毒3 min, 用无菌蒸馏水冲洗3遍, 用灭菌滤纸吸干种子表面水分, 均匀摆放在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上, 每皿50粒, 4个重复, 在25 ℃黑暗下培养, 分别在第4天和第7天统计每粒种子上生长出的真菌菌落数量和种类, 并及时纯化、鉴定。

孢子悬浮液的制备。将沙打旺种子上分离率最高的3种病原菌— — 镰刀菌(Fusarium spp.)、埃里砖格孢(Embellisia astragali)、链格孢(Alternaria sp.)置于25 ℃恒温培养箱(Sanyo Incubator, Japan)中PDA培养基上密封培养使病原菌产孢。每皿加入无菌水5 mL, 用灭菌的载玻片轻轻刮下孢子, 经双层纱布过滤后, 用血球计数板将孢子悬浮液浓度调节为5× 10⁵个· mL^-1, 备用。

盆栽用土为黄壤土, 取自兰州大学草地农业科技学院榆中实验田(104.1° E、35.9° N)。按照土壤养分系统研究法(ASI法)^[28]测定土壤基本指标。结果显示, 土壤pH 7.8, 土壤速效氮、速效磷和速效钾含量分别为92.6、30.2和110.9 mg· kg^-1。先过筛(2 mm孔径)剔除杂物, 平铺在瓷盘上约3 cm厚, 将瓷盘放置在烘箱(DHG-9420A, 上海一恒科技有限公司)中, 169 ℃下灭菌5 h^[29], 降温后装在塑料大桶中, 盖上桶盖备用。每次称取灭菌土壤1 000 g, 装在塑料花盆(底部开孔, 盆底直径120 mm, 盆口直径150 mm, 盆高140 mm)中用以种植沙打旺。

土壤灭菌效果检验:用以上方法灭菌的土壤, 在超净工作台上, 铺在PDA培养基表面, 25℃黑暗条件下培养2周, 无任何菌物长出^[18]。

土壤最大持水量(W)检测^[30]:将装有灭菌土壤的花盆放置于略大于花盆底部的塑料盆中, 反复向花盆中浇水, 直至花盆底部流出的水与塑料盆口同高。然后将花盆口用塑料薄膜封住, 共设置5个重复。放置24 h后, 将花盆从塑料盆中取出, 擦去花盆表面的水分再称重, 得到总重(W₁)。再将花盆放置于80 ℃烘箱中烘干24 h, 反复至重量再无变化时记录干重(W₂)。根据公式W=W₁-W₂计算土壤最大持水量, 本研究中每盆土壤平均最大持水量为280 g。

本研究中3种杀菌剂都购自兰州市安宁区农药市场, 均为可湿性粉剂(四川国光农化公司)。用无菌水配制杀菌剂溶液, 分别为0.1%多菌灵溶液、0.1%代森锰锌溶液和0.1%甲基托布津溶液。

将健康、饱满的沙打旺种子用蒸馏水冲洗干净, 先后浸于75%酒精溶液(1 min)和1%次氯酸钠溶液(10 min)进行表面消毒, 再用无菌水冲洗5遍, 用灭菌滤纸吸干种子表面水分。待种子干燥后, 再分别浸于无菌水(CK₁和CK₂)、0.1%多菌灵溶液、0.1%代森锰锌溶液和0.1%甲基托布津溶液中, 10 min后取出晾干。

1.6.1 培养皿试验 在无菌条件下将预处理好的种子放置于铺有双层灭菌滤纸的培养皿中, 每皿50粒, 每个处理10个重复。CK₁(无杀菌剂处理, 无人工接种)每皿倒入无菌水10 mL; 将3种病原菌的孢子悬浮液按1:1:1的比例混合均匀倒入CK₂(无杀菌剂处理, 有人工接种)和其它处理(有杀菌剂处理, 有人工接种)的培养皿中, 每皿10 mL。按照国家种子检验规程, 将培养皿置于培养箱中20 ℃条件下黑暗培养。

1.6.2 盆栽试验 将预处理种子摆放在装有1 000 g灭菌土壤的花盆中, 每盆10粒均匀排列, 表面覆土约5 mm, 每个处理10盆。将所有花盆放在温度为20 ℃/-25 ℃(夜晚/白天), 相对湿度80%, 12 h光照、12 h黑暗, 光照强度为12 000 lx的温室中培养。第1-14天, CK₁每天每盆浇入无菌水10 mL作为对照, CK₂和其它处理每天每盆浇入混合孢子悬浮液10 mL。之后所有盆每3 d浇水一次, 每次浇水120 mL, 约达到土壤最大持水量的70%。试验周期为12周。

发芽率:从种子摆放在培养皿内, 每天统计一次发芽数, 计算发芽率, 共统计14 d^[31]。

出苗率:播种后每天统计一次出苗数, 计算出苗率, 共统计14 d。

株高、发病率、死亡率:每周测量一次所有接种植株和对照植株的株高(卷尺测量), 同时统计发病率和死亡率。

根长、干重:第12周收获时, 将所有植株用自来水轻轻冲洗干净, 测量根长、苗长。之后将植株置于80 ℃烘箱中烘干36 h, 称干重。

病情指数:观察地上部分及根部症状, 根据以下病情严重等级分级标准, 确定病情指数。

地上部分病情严重指数分级标准^[32]:0级, 无症状; 1级, 矮化, 但无叶斑; 2级, 有叶斑, 但无病侧枝; 3级, 茎秆基部变色; 4级, 茎秆基部或颈部有病枝; 5级, 植株死亡。

根据病情严重等级^[33], 计算病情指数(disease severity index, DSI):

DSI= ∑(病情严重指数×相应种子数)最大严重指数×所有种子数× 100。

病原菌再分离:第12周收获后, 将病株上的叶片、茎秆和根部经过表面消毒后切成5 mm小段放置在PDA培养基上进行接种病原菌的再分离。

所有数据用Microsoft Excel 2010作图, 并用SPSS 19.0分析, 对发芽率、出苗率、根苗长、单株干重、发病率、死亡率以及病情指数几个指标采用单因素方差分析方法, 对各指标进行不同处理间差异显著性分析。

在沙打旺种子上共分离出真菌13种(表1)。分离率较高并且普遍存在的真菌有埃里砖格孢(Embellisiaastragali)、链格孢(Alternaria sp.)和镰刀菌(Fusarium spp.)。

1-3 d对照与处理的种子发芽率均较低, 为4%~18%。4-7 d, CK₁和3个杀菌剂处理的发芽率均上升较快, 在54%~62%, 而CK₂发芽率上升缓慢, 仅为14%。8-14 d, CK₁和3个处理的发芽率上升速度放缓, 14 d时发芽率为67%~89%。CK₂发芽率始终较低, 14 d发芽种子仅有27%。统计结束时, CK₁的发芽率是CK₂发芽率的234%, 多菌灵处理的发芽率是CK₂的179%, 代森锰锌处理的发芽率是CK₂的185%, 甲基托布津处理的发芽率是CK₂的151%(图1)。

图1

Fig.1

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	图1 杀菌剂对培养皿中沙打旺种子发芽率的影响 注:不同小写字母表示14 d时不同处理间差异显著(P< 0.05)。图2、表3同。Fig.1 Effects of fungicide on germination percentage of standing milkvetch seeds inoculation in petri dishes Note: Different lower case letters indicate significant difference among different fungicide treatments at 14 d at 0.05 level. The same in Fig.2 and Table 3.

图2

Fig.2

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	图2 杀菌剂对盆栽沙打旺种子出苗率的影响Fig.2 Effects of fungicide on emergence percentage of standing milkvetch seeds plants in pots

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 沙打旺种子上分离出的真菌及其分离率 Table 1 Percent frequency of fungi isolated from the seeds of standing milkvetch 真菌名称 Name of fungi 分离率 Isolation rate/% 真菌名称 Name of fungi 分离率 Isolation rate/% Embellisia astragali 19 Aspergulas spp. 6 Alternaria alternate 21 Penicillium spp. 3 Alternaria sp. 18 Rhizopus 1 Fusarium spp. 15 Stolonifer Verticillium spp. 9 Mucor sitophila 2 Ascochyta sp. 9 Stemphylium botryosum 2 Cladosporium herbarum 2

表1 沙打旺种子上分离出的真菌及其分离率 Table 1 Percent frequency of fungi isolated from the seeds of standing milkvetch

CK₁的最终发芽率显著(P< 0.05)高于其它处理的, CK₂的最终发芽发芽率显著(P< 0.05)低于其它处理的, 代森锰锌处理的最终发芽发芽率显著(P< 0.05)高于甲基托布津处理的(图1)。

1-4 d对照与处理的种子出苗率均较低, 为7%~10%。5-9 d, CK₁和3个杀菌剂处理的出苗率均上升较快, 达到48%~61%, 而CK₂出苗率上升缓慢, 仅为16%。7-14 d, CK₁和3个处理的出苗率上升速度放缓, 14 d时出苗率为59%~83%。CK₂出苗率始终较低, 14 d出苗种子仅有22%。CK₁最终出苗率是CK₂的284%, 多菌灵处理最终出苗率是CK₂的209%, 代森锰锌处理最终出苗率是CK₂的214%, 甲基托布津处理最终出苗率是CK₂的172%(图2)。

CK₁的最终出苗率显著(P< 0.05)高于其它处理的, CK₂的最终出苗率显著(P< 0.05)低于其它处理的, 多菌灵和代森锰锌处理的最终出苗显著(P< 0.05)高于甲基托布津处理的(图2)。

所有盆栽试验中种子出苗2周后, 植株地上部分开始明显增长。与发芽率相似, CK₁和杀菌剂处理种子的株高持续高于CK₂的。12周观察结束时, CK₁植株的株高显著(P< 0.05)高于多菌灵处理、代森锰锌处理和甲基托布津处理的。与CK₁、多菌灵、代森锰锌和甲基托布津处理相比, CK₂植株的株高分别显著降低了62%、42%、46%和41%(P< 0.05)(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 杀菌剂处理对沙打旺植株平均株高和根长的影响Fig.3 Effects of fungicide on plant height and root length of standing milkvetch 12 weeks after planting in pots

12周观察结束时, 各处理根长与株高表现出相似趋势。CK₁的平均根长显著(P< 0.05)大于CK₂、多菌灵处理、代森锰锌处理和甲基托布津处理的。多菌灵、代森锰锌与甲基托布津处理间均差异不显著(P> 0.05)。CK₂处理的根长显著(P< 0.05)低于其它处理的, 分别为CK₁、多菌灵、代森锰锌和甲基托布津处理根长的54%、45%、41%和31%(图3)。

在盆栽试验中, CK₁的单株干重为1.42 g, 显著(P< 0.05)高于其它处理的; CK₂单株干重为0.46 g, 显著(P< 0.05)低于其它处理; 多菌灵、代森锰锌和甲基托布津3个处理之间的单株干重无显著差异(P> 0.05)(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 杀菌剂处理对沙打旺单株干重、发病率死亡率和病情指数的影响 Table 2 Effect of fungicide on dry weight of single plant, incidence, mortality and DSI of standing milkvetchin pots experiment 处理 Treatment 单株干重 Dry weight of single plant/g 发病率 Incidence/% 死亡率 Mortality/% 病情指数 DSI 对照1 CK1 1.42± 0.11a 6.00± 0.52d 3.00± 0.21d 2.40± 0.17c 对照2 CK2 0.46± 0.04c 87.00± 4.89a 61.00± 4.87a 75.60± 5.29a 多菌灵Carbendazim 1.05± 0.08b 51.00± 3.57bc 31.00± 2.17b 40.80± 2.66b 代森锰锌Mancozeb 1.12± 0.09b 47.00± 3.21c 26.00± 1.92c 36.60± 2.56b 甲基托布津Thiophanate-Methyl 0.98± 0.07b 56.00± 3.82b 33.00± 2.21b 43.20± 2.93b

表2 杀菌剂处理对沙打旺单株干重、发病率死亡率和病情指数的影响 Table 2 Effect of fungicide on dry weight of single plant, incidence, mortality and DSI of standing milkvetchin pots experiment

盆栽试验中, CK₁并未人工接种病原真菌, 发病率仅为6%, 显著(P< 0.05)低于其它各处理。CK₂进行了人工接种病原菌, 但没有杀菌剂预处理, 发病率为87%, 显著(P< 0.05)高于其它各处理。3个杀菌剂处理中, 代森锰锌处理的发病率为47%, 显著(P< 0.05)低于甲基托布津处理的(表2)。

各组植株死亡率表现出与发病率相似趋势。CK₁的死亡率仅为3%, 显著(P< 0.05)低于其它各处理的。CK₂的死亡率为61%, 显著(P< 0.05)高于其它各处理的。3个杀菌剂处理中, 代森锰锌处理的死亡率为26%, 显著(P< 0.05)低于多菌灵和甲基托布津处理的(表2)。

病情指数为3种病原真菌导致病害病情指数的平均值, 可以综合衡量植株的发病率和严重程度。本研究中, CK₁的病情指数为2.4, 显著(P< 0.05)低于其它各处理的。CK₂的病情指数为75.6, 显著(P< 0.05)高于其它各处理的, 有相当一部分植株死亡, 存活植株的病情也较严重。3个杀菌剂处理的病情指数为36.60~43.20, 差异不显著(P> 0.05)(表2)。