不同浓度镉胁迫对孔雀草DNA甲基化的影响
张凯凯, 陈兴银, 杨鹏, 关萍
贵州大学生命科学学院,贵州 贵阳 550025
通信作者:关萍(1962-),女,安徽涡阳人,教授,博士,研究方向为植物分子生物学。 E-mail:guanp508@163.com

第一作者:张凯凯(1991-),男,贵州镇远人,在读硕士生,研究方向为植物发育分子生物学。E-mail:1329487810@qq.com

摘要

随着人类活动、工业化发展进程的加快,重金属污染对环境造成了严重危害。本研究通过盆栽试验,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,对不同浓度镉(Cd)胁迫下孔雀草( Tagetes patula)基因组DNA甲基化变化情况进行了分析研究。结果表明,经0、50、250和500 mg·kg-1浓度Cd2+处理后,基因组MSAP比率分别为24%、30%、35%和41%,全甲基化率分别为20%、23%、25%和27%,这表明重金属胁迫处理后,DNA总甲基化水平随Cd2+浓度升高而呈上升趋势;在DNA甲基化模式变化方面,50、250和500 mg·kg-1浓度胁迫下重新甲基化率分别为10%、10%和11%,重新甲基化为主要的甲基化变化模式。本研究可以为揭示重金属胁迫对植物DNA甲基化变化规律及植物对重金属胁迫耐受性机制提供理论参考。

关键词: 孔雀草; Cd2+胁迫; DNA甲基化; MSAP技术
中图分类号:S543+.9034;Q945.78 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)9-1673-08 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0304
Effects of different concentrations Cd stress on DNA methylation of Tagetes patula
Zhang Kai-kai, Chen Xing-yin, Yang Peng, Guan Ping
College of life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025,China
Corresponding author: Guan Ping E-mail:guanp508@163.com
Abstract

With the speeding up of human’s activity and industrialization process, heavy metal pollution has caused serious harm to the environment. In the present study, the methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) technique was employed to analyze the DNA methylation in Tagetes patula under different concentrations of cadmium(Cd) in pots experiment. The results showed that the genomic MSAP rate of T. patula was 24%, 30%, 35% and 41%, and the total methylation rate of T. patula was 20%, 23%, 25% and 27%, respectively, when treated with the different concetrations of Cd2+(0, 50, 250, 500 mg·kg-1). The results indicated that the total methylation level of DNA increased with the increase of Cd2+ concentration. Moreover, in regards of the change pattern of DNA methylation, the denove methylation rates were 10%, 10% and 11%, respectively, under stress of 50, 250 and 500 mg·kg-1 Cd2+, which indicated that the denove methylation was the main methylation pattern. In summay, the current study provides a theoretical reference for revealing the variation trend of heavy metal stress on plant DNA methylation and the mechanism of plant tolerance to heavy metal stress.

Keyword: Tagetes patula; Cd stress; DNA methylation; MSAP technique

随着人类活动的加剧, 工业化发展进程加快, 大量重金属污染物进入环境中, 其中以镉(Cd)、砷(As)、镍(Ni)、铅(Pb)等重金属污染为主。重金属微量元素具有迁移性强且易富集等特点, 因而能长时间滞留在环境中, 对动、植物造成严重危害, 同时给环境保护工作增加了难度。Cd是当今重金属污染的主要元素之一, 其污染面积大且毒性强, 仅次于汞(Hg)[1, 2], 对人类健康造成了严重影响, 如致病、致癌、致畸等[3]。Cd不是植物生长发育所需的营养元素, 但在含Cd土壤中易通过植物根部进入植物体内; 当植物所生长的土壤中Cd含量超过一定浓度时, 便会在植物体内累积并发生一系列活性氧反应, 阻滞植物的生长发育, 使得植物出现生长缓慢、植株矮小、叶片褪绿、产量降低等症状, 有时甚至出现植株死亡的现象[4, 5]。目前关于重金属对植物的危害研究多停留在生理生化反应方面, 较少涉及对植物遗传物质影响的研究。前人研究证实重金属会对植物DNA等生物大分子造成损害, 破坏DNA的分子构象、改变DNA特异性结合位点活性、造成DNA单双链断裂、姐妹染色单体交换、影响DNA与蛋白质的相互作用[6, 7]等, 严重影响DNA的空间结构、基因的稳定遗传和DNA甲基化水平, 同时在基因的表观修饰调控方面也产生影响, 还能遗传给下一代, 这对植物的生长发育和繁殖是不利的。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)催化下, 将S腺苷甲硫氨酸上的(SAM)甲基基团(-CH3)结合到DNA分子链上的过程[8], 其中甲基化合物主要在CpG位点发生, 形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化作为一种重要的表现遗传修饰形式, 在生物界普遍存在, 是真核细胞调控基因表达、维持基因组稳定从而确保植物正常生长发育的重要手段之一[9]。重金属能显著提高小麦(Triticum aestivum)和水稻(Oryza sativa)DNA甲基化的水平[10]。研究表明, 植物在应对重金属Cd胁迫时, 基因组DNA甲基化水平和状态会发生较大程度的动态变化, 引起基因调控功能失常, 影响植物的正常生长[11]。由于重金属胁迫引起了玉米(Zea mays)DNA胞嘧啶甲基化不同程度的改变, 使得叶片中蛋白质的合成明显受阻; 同时锌(Zn)对玉米幼苗的胁迫使得DNA甲基化升高, 并且体内激素含量明显降低[12, 13]

甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术最初由Reyna-Lopez建立, 是以扩增片段长度多态性(AFLP)的基础上建立起来的分子标记技术[14], 采用能够识别同一5’ -CCGG-3’ 位点的同裂酶HapⅡ 和MspⅠ 消化基因组DNA, 依据两种酶对CCGG位点不同甲基化的敏感性差异来检测CCGG位点的甲基化水平和模式[15]。HapⅡ 和MspⅠ 均可以识别未甲基化的CCGG位点, 当CCGG位点内部胞嘧啶发生双链甲基化时, MspⅠ 可以切割, 而HapⅡ 则可以切割外侧胞嘧啶发生单链甲基化的CCGG位点, 此外, 对内部胞嘧啶单链甲基化的CCGG位点, 两种酶也表现出一定的活性, 而其它的甲基化形式则不能切割。

孔雀草(Tagetes patula)为菊科万寿菊属一年生草本植物, 是目前花坛应用的主要花草之一[16], 从重金属生理胁迫方面的研究表明, 孔雀草对Cd具有很强的富集及抗性能力[17], 而关于重金属Cd胁迫对孔雀草基因组DNA甲基化水平影响的研究, 未见报道。本研究运用MSAP分子标记技术, 分析孔雀草基因组DNA甲基化水平和模式随不同浓度Cd胁迫处理的变化情况, 以期为揭示重金属胁迫对植物DNA甲基化变化规律及植物对重金属胁迫耐受性机制提供理论参考。

1 材料与方法
1.1 供试材料与植物培养

供试孔雀草种子采自贵阳市花溪区生态园。选取大小均一且饱满的种子用75%酒精消毒3 min, 蒸馏水冲洗数次, 于光照培养箱中26 ℃蒸馏水浸泡催芽24 h, 将种子播种于含500 g全营养土的15 cm口径花盆中, 每盆15粒种子, 在光照培养箱中进行培养, 温度控制在25~30 ℃。用蒸馏水进行浇灌培养, 每天一次, 水量以不渗出盆底为准。

1.2 Cd胁迫处理

在播种完后, 对土壤进行Cd胁迫, 分别按50、250和500 mg· kg-1 Cd2+浓度称取CdCl2· 2.5H2O, 分别溶于适量蒸馏水中并浇灌土壤, 每浓度处理设3个重复, 以蒸馏水处理组作为对照组。胁迫处理时间为30 d。

1.3 DNA提取与检测

DNA提取采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取, 选取生长一致的真叶约200 mg提取基因组DNA。基因组DNA用TE溶解, DNA浓度用ThermoFisher公司的超微量紫外可见分光光度仪(NanoDrop2000)检测, 检测结果OD(260/280)比值在1.80左右, DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 保存于-20 ℃冰箱中作为后续试验模板。

1.4 MSAP分析

用EcoRⅠ /HapⅡ 和EcoRⅠ /MspⅠ 两组酶, 对不同Cd浓度处理的孔雀草基因组DNA分别进行双酶切。其中分两次对DNA进行酶切, EcoRⅠ 酶切体系(40 μ L):4 μ L 10× Buffer EcoRⅠ , 1 μ L EcoRⅠ (10 U· μ L-1), DNA模板30 μ L(约300 ng), 5 μ L ddH2O, 充分混匀后37 ℃酶切4 h。HapⅡ 或MspⅠ 酶切体系(20 μ L):2 μ L 10× BufferTango, 0.25 μ L HapⅡ (10 U· μ L-1)或MspⅠ (10 U· μ L-1), 10 μ L EcoRⅠ 酶切产物, 7.75 μ L ddH2O, 充分混匀后37 ℃酶切5 h。

将酶切产物片段两端分别接上与EcoRⅠ 和HapⅡ /MspⅠ 酶切产物互补的特异性接头(表1), 接头序列连接前需要进行变性退火, 得到双链接头终浓度为5 pmol· μ L-1(E)和50 pmol· μ L-1(H/M)的接头母液, 连接体系(30 μ L):3 μ L 10× T4DNA Ligase buffer, EcoRⅠ 和HapⅡ /MspⅠ 接头各1 μ L, 酶切产物20 μ L, T4连接酶(5 U· μ L-1)0.5 μ L, 4.5 μ L ddH2O, 充分混匀后22 ℃连接5 h, 产物-20 ℃保存作为预扩增模板。

表1 MSAP反应接头与引物 Table 1 Sequence of adapters and primers in MSAP

预扩增反应体系(20 μ L):2 μ L连接产物, 2 μ L的E-00及HapⅡ /MspⅠ -00预扩增引物(表1), 10 μ L 2× PCR Master Mix, 4 μ L ddH2O, 反应混合液轻轻混匀, 预扩增反应程序为:94 ℃, 2 min; (94 ℃, 30 s; 56 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min)35 个循坏; 72 ℃, 10 min; 4 ℃保存。将预扩增产物稀释50倍用于选择性扩增模板。

选择性扩增反应体系(20 μ L):3 μ L预扩增稀释产物, 2 μ L选择性扩增引物E+ANN(5 μ mol· L-1)及H/M+TNN(5 μ mol· L-1)(表1), 5 μ L 2× PCR Master Mix, 8 μ L ddH2O, 充分混匀反应液, 扩增反应程序为:94 ℃, 30 s; 65 ℃, 30 s, 每个循环减少 0.7 ℃; 72 ℃, 2 min; 13个循环; (94 ℃, 30 s; 56 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min)29 个循坏; 72 ℃, 10 min; 4 ℃保存。

MSAP扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 0.1%硝酸银染色, 拍照及条带记录; 同一酶切位点条带的有、无分别用1、0表示, 最后对带型统计分析。

2 结果与分析
2.1 Cd2+胁迫处理对孔雀草基因组DNA甲基化水平的影响

MspⅠ 和HapⅡ 两种酶都识别5'-CCGG-3'位点, 利用与EcoRⅠ 组成双酶切组合对孔雀草总DNA进行切割。由于MspⅠ 和HapⅡ 两种酶对CCGG位点甲基化不同模式敏感性的不同, 产生不同大小的酶切片段, 在PAGE图上也产生了不同类型的条带。如图1所示, 双酶切后的PAGE胶图上出现了3种甲基化形式:1)E+M有条带, E+H无条带, 即(1、0)型, 表明只有MspⅠ 酶切割, CCGG位点发生全甲基化(图1A); 2)E+M无条带, E+H有条带, 即(0、1)型, 表明只有HapⅡ 切割, CCGG位点发生半甲基化(图1B); 3)E+M和E+H两种酶切都有条带, 表明CCGG未发生甲基化(图1C)。孔雀草MSAP甲基化形式跟黄瓜(Cucumis sativus)、小麦、萝卜(Raphanus sativus)、水稻等研究结果一致[18, 19, 20]

图1 孔雀草DNA全甲基化(A)、半甲基化(B)和未甲基化(C)MSAP条带类型
注:(M1、H1)、(M2、H2)和(M3、H3)代表不同引物扩增条带。
Fig.1 MSAP band type of fully methylated (A), hemimethylated (B) and unmethylated (C) of Tagetes patula genome DNA
Note: (M1, H1), (M2, H2) and (M3, H3) are amplification fragments of the different primers, respectively.

从24对选择性扩增引物(3条E引物和8条H/M引物配对)中(表1), 根据MSAP产物扩增条带清晰度、扩增条数、重复性好坏程度筛选出11对引物, 对4种不同浓度Cd胁迫下孔雀草DNA甲基化进行甲基化敏感扩增多态性分析。结果得出, 0、50、250和500 mg· kg-1 Cd2+浓度胁迫下, 孔雀草DNA甲基化电泳图中总扩增条带数分别为197、208、220和237(表2), 总MSAP率(包括全甲基化率和半甲基化率)分别为24%、30%、35%和41%; 全甲基化带型条数分别为39、48、55和63条, 全甲基化率分别为20%、23%、25%和27%, 半甲基化率分别为4%、6%、10%和14%。

表2 不同Cd2+浓度胁迫对孔雀草基因组DNA甲基化水平的影响 Table 2 Methylation levels of Tagetes patula genome DNA under Cd2+ stress at different concentrations

由此可知, 在重金属Cd2+胁迫处理下, 孔雀草基因组DNA甲基化程度明显增强, 并且甲基化增加水平与Cd2+浓度之间呈明显的剂量效应关系, 同时, 发生重新甲基化的扩增位点数要高于去甲基化的扩增位点数, 并且全甲基化率高于半甲基化率, 得出双链全甲基化在孔雀草基因组CCGG位点甲基化中占主要比例。所以, 随着胁迫浓度的升高, 总甲基化水平最终升高。

2.2 Cd2+胁迫处理对孔雀草基因组DNA甲基化状态的影响

为检测孔雀草在重金属Cd2+胁迫处理下DNA甲基化的动态变化情况, 对扩增条带做了统计分析。为了方便统计, 在带型分析中, 将EcoRⅠ /MspⅠ 酶切扩增泳道记作M, EcoRⅠ /HapⅡ 酶切扩增的泳道记作H。同一位点, 有扩增条带用“ 1” 表示, 无扩增条带的用“ 0” 表示(表3)。

表3 不同Cd2+浓度胁迫对孔雀草基因组DNA甲基化状态的变化 Table 3 Pattern changes of Tagetes patula genome DNA under Cd2+ stress at different concentrations

3种不同浓度Cd2+浓度胁迫处理与对照的甲基化敏感性扩增共出现了9种带型, 总体可以分为两大类。1)单态类, 这一类的特点是处理组的甲基化状态跟对照组的甲基化模式一样(图2中D1、D2、D3), 表明在重金属Cd2+处理前、后CCGG位点甲基化状态未变化。D1为未甲基化类型, 此时MspⅠ 酶及HapⅡ 酶都可以识别并切割位点, 得到(1、1、1、1)的带型; D2为半甲基化类型, 此时HapⅡ 酶能识别并切割, MspⅠ 酶不能识别, 从而得到(0、1、0、1)的带型; D3为全甲基化类型, 此时MspⅠ 酶识别并切割, HapⅡ 酶不能识别, 从而得到(1、0、1、0)的带型; 2)多态类, 这一类的特点是处理组跟对照组的甲基化模式不一样(图2中A、B、C), 表明在重金属Cd2+处理前、后CCGG位点甲基化状态发生了变化, 包括重新甲基化A类, 其特点是对照没有发生甲基化(M、H都有条带), 但处理后发生了甲基化(M有带或是H有带), 表明孔雀草经Cd2+处理后基因组DNA甲基化程度增加, 如对照组CCGG位点处未甲基化, 处理后发生了半甲基化, 而得到(1、1、0、1)型条带(A1); 去甲基化B类, 其特点是与A类相反, 表明孔雀草经Cd2+处理后基因组DNA甲基化程度降低, 如对照组CCGG位点处全甲基化, 处理后该位点发生去甲基化而得到(1、0、1、1)型条带(B1); 不定类型C类, 其特点是处理组与对照组的甲基化变化程度不能确定。

图2 对照与处理孔雀草基因组DNA的MSAP部分扩增图谱
注:E+AAC/H/M+TCA引物扩增; M、H为对照组; M1、H1为50 mg· kg-1 Cd2+处理组; M2、H2为250 mg· kg-1 Cd2+处理组; Marker为PBR322DNA/MspⅠ 。
Fig.2 Profiles of MSAP in Tagetes patula L DNA between control and treated plants
Note: (M, H), (M1, H1) and (M2, H2) are amplification fragments of E+AAC/H/M+TCA primer, respectively; M1 and H1 are the MSAP patterns under the treatment of 50 mg· kg-1 Cd2+; M2 and H2 are the MSAP patterns under the treatment of 250 mg· kg-1 Cd2+; M and H are those of the control; Marker is PBR322DNA/MSPⅠ .

50、250、500 mg· kg-1 Cd2+胁迫处理的孔雀草基因组DNA多态性甲基化位点数分别为36、36和45, 重新甲基化 (A类)位点数分别为20、21、25, 占基因总扩增位点数的10%、10%、11%(表3); 去甲基化 (B类)位点数分别为15、9、16, 占基因总扩增位点数的7%、4%、5%; 不定类型(C类)位点数分别为1、6、4, 占基因总扩增位点数的0.5%、2%、1%。由此可知, 孔雀草在Cd2+胁迫处理下, 基因组DNA净甲基化水平不断提高, 植物总体甲基化变化程度呈上升趋势。

3 讨论与结论

DNA甲基化作为一种相对保守的表观遗传修饰形式, 对维持植物的正常生长发育、抵御外界不良环境变化具有重要的作用[21], 甲基化水平的改变往往对植物造成不良影响。研究[22]认为, 编码基因启动子区的胞嘧啶经过甲基化修饰后, 启动因子、RNA转录酶的转录起始反应会受到阻碍, 从而引起基因沉默表达; 而基因启动子区的去甲基化对基因具有激活作用, 能促进基因表达。通过研究植物基因组DNA甲基化水平变化, 探索植物抗逆性、生长发育、代谢调控机理, 揭示植物表观遗传调控的分子机制, 对植物的改良、育种具有重要意义。

当植物体受到环境中重金属胁迫时, 植物体通过改变DNA甲基化来调控基因的表达, 以抑制某些基因或启动某些基因的方式来应对不良环境对自身的影响, 从而达到抵御重金属胁迫的作用。研究表明, 重金属胁迫与植物基因组DNA甲基化水平的提高有直接关系[23, 24, 25], 有研究证明, 在Pb胁迫下, 萝卜肉质根基因组DNA甲基化水平明显高于对照(12.1%)[26] , 铬(Cr)胁迫能诱导油菜(Brassica campestris)幼苗基因组DNA甲基化水平提高, 并与胁迫浓度呈显著的剂量效应关系[27]。本研究首次运用MSAP技术对不同浓度Cd2+胁迫下孔雀草基因组DNA甲基化的变化情况进行了分析, 结果表明, 随着Cd2+胁迫浓度的升高, 孔雀草基因组DNA甲基化多态性呈增高趋势(高于对照24%), 这与前述萝卜和油菜的研究结果相符。

植物DNA甲基化主要通过两种方式发生, 一种是通过DNA甲基转移酶来完成, 这种酶主要包括3类:域重排甲基转移酶DRM、甲基转移酶MET和染色质域甲基转移酶CMT, 它们序列上的同源性表现在都含有一个保守的DMTase结构域, 分别被认为与不同形式DNA序列的甲基化有关[28], 植物通过甲基转移酶来维持正常的DNA甲基化, 进而调控植株的生长, 对植物的抗逆境胁迫起着重要的保护作用; 另一种方式是通过外界刺激而导致植物体氧化损伤和非氧化损伤造成DNA甲基化。研究表明, 经X-射线照射后DNA的甲基化变化跟氧化胁迫有直接关系[29], 赵景龙等[30]认为, 重金属胁迫会打破植物体内的正常生理平衡, 造成活性氧的大量积累, 此甲基化方式即是在逆境胁迫超过植物自身所能承受能力时发生的, 由于损伤造成而非基因组正常抗逆调控的甲基化。因此, 植物受到重金属胁迫时, 启动子区甲基化状态的变化是植物应对逆境胁迫、降低毒害的一种重要基因调控方式; 当重金属胁迫超过一定浓度时, 质膜过氧化使得植物体内大量甲基自由基生成, 并对DNA中胞嘧啶进行甲基取代而导致甲基化异常。

植物在受重金属胁迫时, MSAP模式的改变主要包括重新甲基化和去甲基化两种类型[31]。本研究中, 随着Cd2+浓度(0、50、250和500 mg· kg-1)的提高, 重新甲基化数分别占总甲基化多态性扩增位点数的10%、10%、11%; 去甲基化数分别占总甲基化多态性扩增位点数的7%、4%、5%, 基因组DNA净甲基化水平不断提高, 植物总体甲基化变化程度呈上升趋势, 表明孔雀草经重金属Cd2+胁迫处理后, 基因组 DNA重新甲基化和去甲基化是调控基因表达的主要方式, 以此来减少重金属对植物的损伤, 而当重金属持续胁迫并浓度升高时, 植株可能由于过氧化产生过量的自由基而直接导致DNA的氧化损伤, 使其甲基化异常, 并导致植物的生长发育受阻甚至死亡。

综上所述, 孔雀草经Cd2+胁迫处理后, 基因组DNA甲基化水平和模式都发生了改变, 不同Cd2+浓度处理DNA甲基化水平均明显高于无Cd胁迫, 且与浓度呈剂量效应关系。重金属胁迫程度的升高, 使孔雀草DNA甲基化模式也发生了变化, 重新甲基化率随Cd2+浓度升高而提高, 去甲基化率则随胁迫浓度的升高而呈现下降趋势, 且以重新甲基化率的增加为主, 最终导致总体甲基化率的升高。

The authors have declared that no competing interests exist.

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