引用本文
万志文, 曹莹, 陈振江, 李春杰. 温度对醉马草内生真菌共生体幼苗生长和生物碱产量的影响. 草业科学, 2016,33(7):1353-1360
Wan Zhi-wen, Cao Ying, Chen Zhen-jiang, Li Chun-jie. Effects of different temperatures on growth and ergot alkaloids concentrations of Achnatherum inebrians seedling- Epichloё sp. seedling . Pratacultural Science,2016,33(7): 1353-1360  
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温度对醉马草内生真菌共生体幼苗生长和生物碱产量的影响
万志文, 曹莹, 陈振江, 李春杰
草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020
通讯作者:李春杰(1968-),男,甘肃镇原人,教授,博导,博士,研究方向为禾草-内生真菌共生体及草类植物病理学。E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

第一作者:万志文(1992-),女,甘肃天水人,在读硕士生,研究方向为禾草-内生真菌共生体。E-mail:wanzhw14@lzu.edu.cn

收稿日期: 2016-03-11
基金: 国家“973”项目(2014CB138702); 国家自然科学基金项目(31372366); 教育部创新团队发展计划项目(IRT13019)
摘要

研究了不同温度(8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃、22 ℃/15 ℃、28 ℃/25 ℃、35 ℃/28 ℃)处理对醉马草内生真菌共生体幼苗的形态指标、叶绿素、可溶性糖以及麦角酰胺和麦角新碱含量的影响,以期明确共生体幼苗生长和产碱的最适温度。结果表明,株高、根长和生物量均在22 ℃/15 ℃处理下达到最大,其中株高显著( P<0.05)高于其它4个处理,根长显著( P<0.05)高于28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理,生物量显著( P<0.05)高于8 ℃/5 ℃、28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理,分蘖在15 ℃/12 ℃处达到最大,显著( P<0.05)高于8 ℃/5 ℃、28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理。叶绿素在22 ℃/15 ℃处理下达到最大,显著( P<0.05)高于8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃和35 ℃/28 ℃处理。可溶性糖在5个温度处理下差异不显著( P>0.05)。在处理时间为15 d时,麦角酰胺和麦角新碱含量均在22 ℃/15 ℃处理下达到最大。综上所述,最适宜共生体幼苗生长、麦角酰胺和麦角新碱积累的处理温度是22 ℃/15 ℃。

关键词: 醉马草; 内生真菌; 麦角酰胺; 麦角新碱
中图分类号:S543+.9 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)7-1353-08 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0516
Effects of different temperatures on growth and ergot alkaloids concentrations of Achnatherum inebrians seedling- Epichloё sp. seedling
Wan Zhi-wen, Cao Ying, Chen Zhen-jiang, Li Chun-jie
Key Laboratory of Grassland Agro-eystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China
Corresponding author: Li Chun-jie E-mail:chunjie@lzu.edu.cn
Abstract

study was conducted to investigate the effects of different alternate temperatures (8 ℃/5 ℃, 15 ℃/12 ℃, 22 ℃/15 ℃, 28 ℃/25 ℃, 35 ℃/28 ℃) on variations of growth and ergot alkaloids concentrations of Achnatherum inebrians associated with Epichloё sp seedling. The results showed that the plant height, root length and biomass of A. inebrians had peak value under 22 ℃/15 ℃, and the plant height had significant differences ( P<0.05) with the other four treatments; the root length with treatment of 22 ℃/15 ℃ was significant higher ( P<0.05) than that with treatments of 28 ℃/28 ℃, 25 ℃ and 35 ℃/28 ℃; biomass with treatment of 22 ℃/15 ℃ was significant ( P<0.05) higher than that with treatments of 8 ℃/ 5 ℃,28 ℃/25 ℃ and 35 ℃/ 28 ℃. The tiller number of A. inebrians had peak value under 15 ℃/12 ℃,and was significantly ( P<0.05) higher than that with treatment of 8 ℃/5 ℃,28 ℃/25 ℃and 35 ℃/28 ℃. Chlorophyll was maximum under treatment of 15 ℃/22 ℃, and was significant higher ( P<0.05) than that with treatments of 8 ℃/5 ℃,15 ℃/12 ℃and 35 ℃/28 ℃. Soluble sugar had no significant difference between these five temperature treatments. The contents of ergine and ergonovine had a peak value under 22 ℃ / 15 ℃ after 15 d,which had significant difference ( P<0.05) with other treatments. In conclusion, the optimal temperature for seedling growth and the accumulation of ergine and ergonovine treatment was 22 ℃/15 ℃.

Keyword: Achnatherum inebrians; endophyte; ergine; ergonovine

醉马草(Achnatherum inebrians)是禾本科芨芨草属多年生草本植物, 是我国北方天然草原主要的烈性毒草之一, 在内蒙古、新疆、西藏、青海、甘肃等省(区)均有分布[1]。禾草内生真菌(fungal endophyte)是指生长在植株体内并完成全部或大部分生活周期, 而不使寄主植物显示外部症状的一类真菌[2]。1994年美国学者Bruehl等[3]首次在采自我国新疆的醉马草种子中发现了内生真菌。2000年Nan和Li[4]在甘肃省醉马草内发现了内生真菌Neotyphodium, 2004年Li和Nan[5]在甘肃省醉马草内发现了内生真菌新种N. gansuense, 根据最新国际真菌命名法规, 现重新命名为Epichloё gansuensis[6]。其与醉马草是一种互惠共生的关系, 醉马草为内生真菌提供营养物质、光合产物和矿物质, 禾草内生真菌的代谢物能刺激醉马草的生长发育, 并提高其对生物和非生物胁迫的抵抗能力[7, 8, 9]。

禾草内生真菌共生体所产生物碱主要有四大类[10], 分别为吲哚双萜类、吡咯并吡嗪类、麦角碱类和饱和吡咯类。醉马草内生真菌共生体所产的生物碱主要为麦角新碱和麦角酰胺[11], 在其种子、幼苗及成株的不同部位均含有麦角酰胺和麦角新碱[12], 其含量水平与醉马草基因型、生长环境、内生真菌基因型、刈割高度和频度等因素有关[13, 14], 并且施加一定量的外源磷肥、氮肥[15, 16]、外源色氨酸[17]以及干旱和盐胁迫[18]等均可促进醉马草内生真菌共生体中麦角类生物碱的积累。

温度在生物碱的代谢过程中具有积极的调控作用[19], 是影响共生体中麦角生物碱合成的重要因子, 本研究以醉马草内生真菌共生体为供试材料, 通过高效液相色谱检测其在不同温度处理条件下麦角生物碱的含量变化, 以明确醉马草内生真菌共生体幼苗生长和生物碱积累的最适温度条件, 为醉马草内生真菌共生体中麦角酰胺和麦角新碱的分离提纯奠定一定的理论基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料

试验所用的醉马草种子于2014年9月份采自甘肃肃南(100° 33.139' E, 37° 13.823' N), 2015年4月通过镜检, 随机选取一株内生真菌侵染的醉马草植株, 挑选同一株上籽粒饱满、表面健康的种子用于本试验。

1.2 试验方法

1.2.1 对醉马草内生真菌共生体幼苗进行温度处理 挑选同一株上籽粒饱满、表面健康的带菌醉马草种子播种于装有300 g蛭石的聚乙烯花盆(口径15 cm, 底径10 cm, 深12 cm), 在兰州大学榆中校区智能温室[光周期12 h光照, 温度(20± 1) ℃, 光照强度120 μ mol· (m2· s)-1]培养幼苗。每盆幼苗每隔3 d浇水一次, 每周定量浇灌200 mL Hoagland营养液。

待醉马草幼苗生长到6周后, 移入5个光照培养箱(GXZ)进行温度处理。各个培养箱温度梯度设置为(白天/夜晚)8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃、22 ℃/15 ℃、28 ℃/25 ℃、35 ℃/28 ℃, 光照强度均为2 500 lx, 光周期12 h。每个处理5次重复。处理3、6、9、12、15 d后分别取醉马草内生真菌共生体幼苗检测其麦角生物碱含量。处理15 d后, 分别测定醉马草内生真菌共生体幼苗在不同温度处理下的株高、分蘖数、生物量、叶绿素和可溶性糖。

1.2.2 叶绿素含量的测定 叶绿素的测定采用常温浸提比色法:将新鲜植物叶片剪成2 mm左右的碎片, 称取0.1 g样品加入10 mL提取液(乙醇:丙酮=1:3)在室温黑暗条件下浸泡24 h, 期间摇晃两次。取上清液在652 nm波长处测定吸光值, 并按如下公式[20]测定叶绿素的含量(C, mg· g-1):C=A652× 10/(34.5× 称样量)。

1.2.3 可溶性糖的测定 称取鲜样0.1 g 放入试管中, 加蒸馏水5 mL, 封口于沸水中提取1 h, 提取液过滤至25 mL容量瓶, 用蒸馏水反复漂洗残渣并定容至刻度。吸取待测液0.2 mL, 加入试管中, 再加蒸馏水2.3 mL, 摇匀, 随后沿试管壁迅速加入蒽酮试剂6.5 mL, 立即摇匀, 置试管架上冷却至室温, 以添加蒽酮试剂和蒸馏水的空白管作对照, 在620 nm 波长处, 按多点校准法建立标准曲线y=0.111x+0.013 8, R2=0.988, 测定待测管中提取液可溶性糖含量[21] 。

1.2.4 麦角生物碱的提取及其含量的测定 将待测醉马草幼苗在-20 ℃的冰箱冰冻5 h, 并在冷冻干燥机中-60 ℃干燥24 h后, 取出速于研钵中研磨成粉末。称取50 mg样品装于1.5 mL的eppendorf离心管中; 加入1 mL提取液(CHCl3:MeOH:NH4OH=75:25:2), 颠倒混匀, 室温黑暗条件下过夜。 后经15 ℃、10 000 r· min-1条件下离心5 min, 于通风厨中黑暗条件下自然挥发干燥。每个离心管加入0.75 mL的MeOH:CCl4 (1:2)和0.25 mL的25 mmol· L-1酒石酸, 颠倒混匀后, 于离心机(Beckman, Germany)中在21 ℃、12 000 r· min-1条件下离心5 min, 吸取上清液经0.22 μ m孔径的有机相过滤垫过滤至1.5 mL棕色色谱瓶, 待用[16]。

用Agilent 1100 series高效液相色谱系统 (Agilent, USA), Eclipse XDB-C18反相(250 mm× 4.6 mm, 5 μ m)色谱柱, 流动相A为0.1 mmol· L-1NH4OAC, B为乙腈, 按照0-5 min A液的浓度从95%-85%、5-10 min A液的浓度从85%-80%、10-15 min A液的浓度从80%-90%、15-20 min A液的浓度从90%-95%的梯度洗脱; 检测波长(Ex) 312 nm, 发射波长(Em) 427 nm[12], 流速1.0 mL· min-1, 进样量20 μ L, 将麦角酰胺和麦角新碱标样分别稀释至3、1.5、0.75和0.375 mg· kg-1浓度, 各取相同浓度梯度的两种标样混合, 以外标法建立相关标准直线方程, 麦角酰胺:YErgine=466.74XErgine-4.90, R2=0.997[Y表示面积, X表示浓度(mg· kg-1), 下同], 麦角新碱:YErgonovine=483.04XErgonovine-3.90, R2=0.996 90。通过色谱数据工作站软件(ChemStation for LC Rev. A. 10.01, USA)监测进程并测定峰值面积, 根据相关方程和样品稀释的倍数, 计算两种生物碱的浓度。

1.2.5 数据处理 所有数据均用Microsoft Excel录入并作表。采用SPSS 22.0统计分析软件进行方差分析, 用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析
2.1 温度对醉马草内生真菌共生体形态指标的影响

随着处理温度的升高, 醉马草内生真菌共生体幼苗株高呈先增加后下降的趋势, 在处理温度为22 ℃/15 ℃时达到最大, 且显著(P< 0.05)高于其它4个处理(表1)。醉马草幼苗的根长随着温度的升高呈先缓慢升高后下降的趋势, 在 8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃和22 ℃/15 ℃处理下差异不显著(P> 0.05), 但均显著高于28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理。随着处理温度的升高, 醉马草幼苗的分蘖数呈先增多后减少的趋势, 在15 ℃/12 ℃处理下达到最大, 且显著高于8 ℃/5 ℃、28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理。随着温度的升高, 醉马草内生真菌共生体幼苗生物量呈先升高后降低趋势, 在22 ℃/15 ℃达到最大, 且显著高于8 ℃/5 ℃、28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理。

表1 不同温度处理对醉马草幼苗株高、根长、分蘖数和生物量的影响 Table 1 Effects of temperature on the plant height, root length, tiller amount and biomass of Achnatherum inebrians seedlings
2.2 温度对共生体幼苗叶绿素和可溶性糖的影响

不同温度处理下, 醉马草内生真菌共生体幼苗叶绿素的含量有所差别(表2)。在22 ℃/15 ℃和28 ℃/25 ℃处理下, 叶绿素含量显著(P< 0.05)高于8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃和35 ℃/28 ℃处理, 在15 ℃/12 ℃和35 ℃/28 ℃处理下, 醉马草内生真菌共生体幼苗叶绿素的含量显著高于8 ℃/5 ℃处理。醉马草内生真菌共生体幼苗可溶性糖在不同的温度处理之间没有显著 (P> 0.05)变化。

表2 不同温度处理对醉马草幼苗叶绿素和可溶性糖的影响 Table 2 Effects of temperature on the chlorophyll and soluble sugar underground biomass of Achnatherum inebrians seedlings
2.3 温度对共生体麦角生物碱含量的影响

2.3.1 温度对共生体麦角酰胺含量的影响 处理15 d内, 8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃和22 ℃/15 ℃温度处理下麦角酰胺含量随着处理时间的增加呈明显的上升趋势, 均在15 d时达到最大值, 分别为237.60、112.99和239.80 mg· kg-1, 15 d时8 ℃/5 ℃和22 ℃/15 ℃处理下麦角酰胺含量显著(P< 0.05)高于其它3个温度处理; 而28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃处理温度下麦角酰胺含量随着处理时间的增加呈明显的先上升后逐渐降低的趋势, 且均在9 d时达到最大值, 分别为214.44和219.83 mg· kg-1, 显著高于其它温度处理(表3) 。

表3 不同温度和时间处理对醉马草幼苗麦角酰胺(mg· kg-1)的影响 Table 3 Effects of temperature and time treatments on ergine contents (mg· kg-1) in Achnatherum inebrians seedlings
表4 不同温度处理对醉马草幼苗麦角新碱(mg· kg-1)的影响 Table 4 Effects of temperature on ergonovine content (mg· kg-1) in Achnatherum inebrians seedlings

2.3.2 温度对共生体幼苗麦角新碱含量的影响 处理15 d内, 8 ℃/5 ℃、15 ℃/12 ℃和22 ℃/15 ℃温度处理下麦角新碱含量随着处理时间的增加呈明显的上升趋势(表4), 均在15 d时达到最大值, 分别为170.43、180.18和245.43 mg· kg-1, 此时22 ℃/15 ℃处理下麦角新碱含量显著(P< 0.05)高于其它4个温度处理。28 ℃/25 ℃处理下麦角新碱含量随着处理时间的增加呈逐渐上升的趋势, 到12 d时达到最大值139.19 mg· kg-1, 之后又缓慢下降。35 ℃/28 ℃处理下麦角新碱含量随着处理时间的增加呈先上升后降低的趋势, 在9 d时达到最大值197.64 mg· kg-1, 且显著高于其它温度处理。

3 讨论与结论
3.1 温度对共生体幼苗生长的影响

植物的株高、分蘖数和生物量等形态指标是植物生长发育状态的直接表现, 温度是影响植物生长的重要环境因子之一。本研究表明, 过低或过高的温度均不利于醉马草内生真菌共生体幼苗的生长, 在22 ℃/15 ℃处理下醉马草内生真菌共生幼苗的株高、根长和生物量均达到最大, 最有利于幼苗分蘖的温度是15 ℃/12 ℃。植物在低温或高温条件下, 各个生理过程均会受到不同程度的干扰, 其中光合作用是受低温影响较明显的过程之一[22]。叶绿素是参与植物光合作用的重要色素, 其含量的多少直接影响光合作用的强弱。有研究表明, 低温使叶片内叶绿素含量有所下降, 其原因多种多样, 最常见的观点有以下两种:第一, 认为在逆境条件下, 由于活性氧在细胞中的积累并扩散到叶绿体中, 导致叶绿素降解[23]; 第二, 低温胁迫对叶绿体结构有一定的影响, 许多研究者观察到在较低的零上低温下, 叶绿体形态上发生变形, 膜系统受到破坏, 例如叶绿体被膜和类囊体膜发生断裂、基粒垛叠消失、基质内产生小泡、整个叶绿体呈膨胀状态[24]。 同样, 在高温胁迫下叶绿素的含量也会有所下降, 原因可能有两个:一是高温胁迫影响叶绿素合成的中间产物5-氨基酮戊酸和卟啉Ⅸ 的生物合成, 降低叶绿素的生成量[25]; 二是高温胁迫下发生光氧化反应, 使植物体内的活性氧产生量上升, 导致叶绿素含量减少[26, 27]。高温胁迫导致黄瓜(Cucumic sativus)叶片叶绿素含量的明显下降, 可能是由于高温引起活性氧积累发生氧化破坏, 加速了叶绿素的降解[28]。与以上结论相似, 本研究表明, 在低温和高温处理下, 醉马草内生真菌共生体幼苗叶绿素的含量显著下降, 22 ℃/15 ℃和28 ℃/25 ℃处理温度最适宜叶绿素含量的积累。

可溶性糖为渗透调节物质, 是生物体中重要的能源和碳源, 并且在抗逆作用中是一个渗透调节因子。有研究表明, 当受到温度胁迫时, 几种冷季型草坪草体内可溶性糖含量均比常温时有所增加, 主要是由于温度胁迫使淀粉等大分子物质降解加快, 而可溶性糖的积累可调节组织的渗透势[29]。本研究结果表明, 低温和高温处理下可溶性糖略高于常温处理, 但增幅不明显。

3.2 温度对共生体幼苗麦角生物碱含量的影响

生物碱是植物在长期的生态环境适应过程中为抵御动物、微生物、病毒及其它植物的攻击而形成的一大类次生代谢产物[19], 作为植物的化学防御武器, 在植物的生长、发育和繁殖过程中具有积极的作用。影响生物碱含量的因素主要有两类, 一是生物因子, 例如:寄主植物的基因型、内生真菌的基因型和与生物碱合成相关的酶[30]; 二是非生物因子, 例如光照、温度、海拔高度、土壤水分和营养物质的供给[10, 17]。家畜采食醉马草会出现精神呆钝、食欲不好、步履不整、蹒跚如醉等中毒症状[31, 32], 李春杰等[33]以家兔为试验对象, 证实了醉马草与内生真菌互作所产生麦角酰胺和麦角新碱是引起家畜中毒的主要原因, 家畜所表现的中毒症状与麦角酰胺和麦角新碱的作用机理相吻合。昆虫一般拒食含有生物碱的禾草, 从而形成了对禾草的保护, 相比于内生真菌侵染的醉马草, 禾谷缢管蚜更倾向于取食未被内生真菌侵染的醉马草[34], 因此将可以产生生物碱的醉马草内生真菌共生体应用于护坡绿化, 抗虫效果较佳。麦角新碱已被广泛地应用于妇产科临床, 防治妇女产后大出血[35]。而麦角酰胺和麦角新碱都已经被证实可以使伤口周边血流量降低, 因此两者均具有重要的药用开发价值[36]。

温度是影响生物碱含量的重要环境因子, 不同的温度会使禾草内生真菌共生体内生物碱的累积量呈现不同水平的变化, 有学者研究发现, 多年生黑麦草中peramine和lolitrem B在夏季高温少雨的情况下会达到最大积累量[37], 不同生物碱在不同的温度处理下会呈现不同的变化, 其含量也会随着时间的推移上下波动, 在高温处理一个月的高羊茅(Festuca arundinacea)中, 裸麦角碱和麦角酰胺含量明显降低, 而麦角缬氨酸的含量明显上升[38]。研究发现, 麦角酰胺在高温(28 ℃/25 ℃和35 ℃/28 ℃)处理9 d时出现峰值, 是所有处理出现峰值最早的, 之后, 28 ℃/25 ℃处理下的麦角酰胺含量有缓慢的下降趋势, 35 ℃/28 ℃处理下麦角酰胺的含量则显著下降, 到15 d时达到最小值, 说明在短时间的高温胁迫可以刺激共生体产生更多的麦角酰胺, 但随着处理时间的延长其含量会降低。低温处理(8 ℃/5 ℃)下, 麦角酰胺含量随着处理时间的延长而增加, 但在12 d之后的增加速率明显减慢, 基本呈不变趋势, 说明短时间的低温胁迫有利于生物碱的积累, 这与Zhou等[39]对中华羊茅(F. sinensis)的研究一致。正常温度(15 ℃/12 ℃和22 ℃/15 ℃)下, 麦角酰胺含量逐渐上升, 在处理15 d时达到峰值, 此时22 ℃/15 ℃温度处理下积累的麦角酰胺最多。麦角新碱在高温35 ℃/28 ℃处理下9 d时出现峰值, 28℃/25 ℃处理下12 d时出现峰值, 但二者所积累的量较少, 在低温(8 ℃/5 ℃)和正常温度(15 ℃/12 ℃和22 ℃/15 ℃)处理下, 麦角新碱含量均呈上升趋势, 且在15 d时达到最大, 此时22 ℃/15 ℃温度处理下积累的麦角新碱最多。综上所述, 在高温胁迫下醉马草内生真菌共生体幼苗产碱在短时间内会出现峰值, 但超过一定的时间范围其含量会出现下降的趋势, 这可能是由于麦角生物碱在植物体内是以游离化合物形式存在, 因此其化学结构不稳定, 容易受外界环境条件影响而异构化, 高温使得积累的生物碱降解。在低温处理下, 麦角酰胺在短时间内积累较快, 但过了12 d后积累速率明显下降, 而麦角新碱含量虽在缓慢增加, 但积累量少。出现以上两种结果除了可能跟生物碱结构破坏有关外还可能跟生物碱形成相关的酶的活性有密切关系, 长时间的低温或高温处理后酶活性降低, 从而导致生物碱的合成受阻。陈娜[40]研究表明, 被内生真菌侵染的醉马草种子在低温萌发过程有关通过莽草酸途径色氨酸合成的基因大量表达, 而二甲稀丙基色氨酸合酶(dimethylallytrytophan synthase, DMATS) 已被证明是整个麦角生物碱的合成过程中的限速酶, 色氨酸既是共生体中麦角碱生物合成的前体也是该关键酶的诱导物, 这也是短时间的低温有利于产生麦角碱的原因之一。正常温度下两种麦角生物碱的积累随着处理时间延长达到最大且不会出现降解, 最适宜分离。

本研究对醉马草内生真菌共生体幼苗的生长和麦角生物碱积累的最适温度条件进行了研究, 综合幼苗生长和产碱, 最适温度条件是22 ℃/15 ℃, 但温度影响产碱的具体生理生化机制有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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