引用本文
付萍. 根瘤菌对箭筈豌豆结瘤固氮的影响. 草业科学, 2016,33(4):584-588
Fu Ping. Effects of different rhizobia on nodulation of Vicia sativa . Pratacultural Science,2016,33(4): 584-588  
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根瘤菌对箭筈豌豆结瘤固氮的影响
付萍
草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020
付萍(1987-),女,甘肃兰州人,硕士,研究方向为草业科学。E-mail:fuping1012@163.com
收稿日期: 2015-05-05
基金: 农业科技成果转化资金项目“兰箭3号春箭筈豌豆新品种示范与推广”(2012GB23600626)
摘要

在温室中低氮营养液培养条件下,用3株不同根瘤菌菌株(CCBAU01069、CCBAU01085和J3)对3个箭筈豌豆( Vicia sativa)品种进行结瘤固氮效果的研究,旨在从中筛选出与箭筈豌豆植株共生匹配最佳的有效根瘤菌菌株,为箭筈豌豆菌肥的研制奠定试验基础。结果表明,与不接菌处理相比,根瘤菌接种可显著促进箭筈豌豆的单株株高、根长、根瘤数、根瘤鲜重、植株全氮含量以及固氮酶活性,所用菌株以CCBAU01069促生,固氮效果最佳。

关键词: 箭筈豌豆; 根瘤菌; 接种; 结瘤固氮
中图分类号:S551+.9 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)4-0584-05 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0126
Effects of different rhizobia on nodulation of Vicia sativa
Fu Ping
Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China
Corresponding author: Fu Ping E-mail:fuping1012@163.com
Abstract

Three rhizobial strains were used to study the nodulation effects of three Vicia sativa cultivars growed in low nitrogen nutrient solution under greenhouse conditions. The results showed that the plant average height, the root length, the amount of nodules, fresh weight of nodules, total nitrogen content and nitrogenase activity of the inoculated V. sativa were significantely increased ( P<0.05) compared with controls and strain CCBAU01069 had the best effects.

Keyword: Vicia sativa; rhizobia; inoculation; nodulation and nitrogen fixation

根瘤菌(Rhizobium)是一类可与豆科作物相互作用形成共生固氮体系的革兰氏阴性杆状细菌[1]。这种共生体系具有很强的固氮能力, 可以通过固定大气中游离的氮气, 为植物提供氮素养料[2], 一方面, 达到了作物增产及培肥地力的重要作用; 另一方面, 减轻了化肥生产带给环境污染的压力与威胁, 对我国农业的可持续发展起到了不可替代的作用[3, 4, 5]。据统计, 每年全球估计有2.0亿t氮来源于生物固氮, 其中仅有25%由它非共生固氮生物所固定, 而根瘤菌与豆科植物所固定的氮约占生物固氮总量的65%[6, 7]。豆科牧草作为生物固氮中最有效的成员, 不但在农业生产中的应用非常广泛, 且具有最显著的经济效益和社会效益。然而, 并不意味着任何根瘤菌对寄主植物都会起到提高其产量或品质的作用, 由于根瘤菌与豆科植物间的共生结瘤是一个竞争过程, 往往根瘤的形成和共生固氮效率的高低是由众多影响因素所决定的, 因此, 生物固氮研究领域中的热点逐渐指向了豆科植物与根瘤菌共生固氮优良组合的筛选[8]。

箭筈豌豆(Vicia sativa), 又名大巢菜, 属豆科(Leguminosae)野豌豆属的一个栽培种; 其原产于欧洲南部和亚洲西部, 于20世纪40年代开始引入我国种植栽培, 在我国种植范围广达新疆、青海、江苏、台湾等29个省(区)[9], 仅在甘肃省的种植面积已扩大到3.4万hm2之多[10]。箭筈豌豆作为一种优良的饲料和绿肥兼用作物, 是生产中使用较为普遍的一类绿肥种质资源[11], 具有耐旱、耐贫瘠、抗逆性强的特点, 其可通过生物固氮作用抑制土壤退化和节约氮肥使用量, 是各种作物的良好前作[12, 13]。由于豆科植物共生固氮在生产、环境和经济中具有举足轻重的作用, 因此对广泛栽培豆科植物最佳共生根瘤菌的筛选也是我国农牧业生产急需解决的问题之一。该研究用3种不同的根瘤菌菌株(CCBAU01069、CCBAU01085和J3)对3个箭筈豌豆品种分别接种后从形态和生理上对其固氮效果进行分析, 旨在从中筛选出与箭筈豌豆植株共生匹配最佳的有效根瘤菌菌株, 为箭筈豌豆菌肥的研制奠定试验基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料

1.1.1供试箭筈豌豆品种 供试材料为兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号, 共3个品种, 均由兰州大学草地农业科技学院提供, 来自该院于2012年在甘肃省甘南州夏河试验点收获所得。

1.1.2供试根瘤菌菌株 供试根瘤菌菌株为CCBAU01069、CCBAU01085和J3, 共3株, 前两株由中国农业大学生物学院微生物与免疫学系、国家农业生物技术重点实验室、农业部土壤微生物重点实验室生命科学研究中心提供, 菌株J3由甘肃农业大学草业学院提供, 以上3种菌株均分离自箭筈豌豆植株。

1.1.3低氮营养液 以Hogland营养液为基础配制的低氮营养液, 其配方(μ mol· L-1)为:CaCl2 2.0× 10-3、Ca(NO3)2 2.0× 10-6、K2SO4 7.5× 10-2、KCl 1× 10-2、MgSO4 6.5× 10-2、EDTA-Fe 1× 10-4、MnSO4 1× 10-6、ZnSO4 1× 10-6、Na2MoO4 5× 10-8、CuSO4 1× 10-7、H3BO3 1× 10-5、KH2PO4 2.5× 102。

1.2 试验方法

1.2.1 根瘤菌菌株的培养 采用平板划线法将菌株CCBAU01069、CCBAU01085和J3分别在根瘤菌培养基(YMA)上对其进行活化, 于28 ℃恒温箱中培养。72 h后在无菌条件下, 挑起单菌落接种于箭筈豌豆根瘤菌YMA液体培养基中, 在28 ℃培养条件下156 r· min-1摇床中培养至菌悬液OD值(λ =600 nm)达到0.6后取出, 置于4 ℃的冰箱中低温保存。

1.2.2 种子处理 挑选大小和饱满度一致且种皮完整的兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号3个品系(或品种)的种子, 用95%的酒精将种子消毒5 min, 取出用无菌水冲洗7~8次。之后在0.2% HgCl2中处理3 min, 再用无菌水冲洗7~8次[14, 15]后备用。

1.2.3 试验设计 试验设菌株CCBAU01069、CCBAU01085、J3和不接菌(对照)4个处理, 3个品种共计12个处理, 每个处理7个重复。选用长23 cm、宽18 cm、高12 cm的塑料花盆, 装入适量的灭菌蛭石。每盆均匀播种6粒已消毒的种子, 并覆盖适量的灭菌蛭石, 出苗后定株5株, 将花盆放入水培盘中, 随机排列。待植株子叶展开后, 将根瘤菌菌悬液(OD600 nm=0.6)等量等浓度地加入每个花盆和营养液中。生长期间每两天浇一次营养液, 每次用0.01 mol· L-1 HCl或0.01 mol· L-1 NaOH将营养液的pH保持在7.0~7.2。试验完全采用随机排列。试验期间温室内平均气温为22 ℃, 日均温25 ℃, 夜均温19 ℃, 光照时间14 h, 光强7 000~8 000 lx。

1.2.4 样品采集与测定 处理45 d(盛花期 )后采集样品并测定各项生理指标, 分别测定株高(直尺)、主根长及根瘤数、根瘤鲜重、植株全氮(凯氏定氮法[16])和固氮酶活性(气相色谱仪乙炔还原法[17, 18])。

1.3 统计分析

采用Microsoft Excel 2003及SPSS 17.0统计软件对试验数据进行分析和处理。

2 结果与分析
2.1 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆株高的影响

箭筈豌豆植株接菌后, 其株高与对照之间差异显著(P< 0.05), 其中以CCBAU01069菌株效果为最佳, CCBAU01085效果次之(图1)。兰箭1号分别接种CCBAU01069、CCBAU01085和J3根瘤菌后, 平均株高分别增加至100.23、 88.75和82.08 cm, 比对照(71.66 cm)增加了39.87%、23.85%和14.54%。兰箭2号平均株高分别增加至87.00、75.75和68.65 cm, 比对照(60.83 cm)增加了43.02%、24.53%和12.86%。兰箭3号平均株高分别增加至77.95、70.05和62.60 cm, 比对照(52.83 cm)增加了47.55%、32.60%和18.50%, 可见, 低氮生长条件下接种根瘤菌对箭筈豌豆的株高有一定促进作用。

图1 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种株高的影响Fig.1 Effects of different strains on plant average height of Vicia sativa

2.2 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆根长的影响

根瘤菌接种对箭筈豌豆植株根长的生长也有一定程度的促进作用, 且除接种CCBAU01085的兰箭2号外各处理均显著高于对照(P< 0.05)。接种CCBAU01069、CCBAU01085、J3根瘤菌后, 兰箭1号的根长分别为28.30、22.35和23.45 cm, 与对照(18.63 cm)相比, 其根长增加了51.91%、19.97%和25.87%。兰箭2号的根长分别为26.95、21.90和22.89 cm, 比对照(18.80 cm)增加了43.35%、16.49%和21.76%, 兰箭3号根长分别为26.30、22.38和20.63 cm, 与对照(17.95 cm)相比, 增加了46.52%、24.68%和14.93%。可见, 接种根瘤菌可提高箭筈豌豆植株的根长, 且不同的菌系与箭筈豌豆的共生有效性有明显的差异(图2)。

图2 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种根长的影响Fig.2 Effects of different strains on Root length of Vicia sativa

2.3 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆根瘤数及根瘤重的影响

根瘤数与根瘤重是反映共生固氮体系相互作用时结瘤的能力。结果(图3、图4)显示, 接种3种根瘤菌菌株可显著提高箭筈豌豆的结瘤能力(P< 0.05), 但不同的箭筈豌豆品种接种不同的根瘤菌后其根瘤总数与根瘤菌鲜重差异较大。其中接种CCBAU01069后, 兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号结瘤能力效果最好, 单株根瘤数与根瘤鲜重分别达到17.25个与0.320 g、18.25个与0.263 g、15.70个与0.155 g, 其他菌系的结瘤能力依次为CCBAU01085(14.50个与0.245 g、14.00个与0.144 8 g、11.50个与0.073 g)、J3(10.75个与0.202 5 g、9.25个与0.094 3 g、8.25个与0.042 6 g), 各处理均与对照之间有显著差异。除兰箭3号CCBAU01085与J3菌株间根瘤鲜重差异不显著外(P> 0.05), 兰箭1号和兰箭2号植株各处理间根瘤数和根瘤鲜重均差异显著。

图3 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种根瘤数的影响Fig.3 Effects of different strains on number of nodules of Vicia sativa

图4 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种根瘤鲜重的影响Fig.4 Effects of different strains on fresh weight of nodules of Vicia sativa

2.4 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆固氮酶活性及植株全氮含量的影响

接种根瘤菌后3种箭筈豌豆的固氮酶活性以及植株全氮含量显著高于对照(P< 0.05), 但不同的菌种间有差异, 其中以CCBAU01069的效果最佳(图5、图6)。不接菌处理下兰箭1号、兰箭2号和兰箭3号固氮酶活性依次为1.6、1.8和2.35 μ g· g-1· h-1。接种菌株CCBAU01069、CCBAU01085和J3后兰箭1号的固氮酶活性依次为57.13、43.80和40.33 μ g· g-1· h-1。兰箭2号的固氮酶活性分别为55.22、42.06和38.14 μ g· g-1· h-1。兰箭3号的固氮酶活性值分别为59.03、47.16和46.53 μ g· g-1· h-1。植株全氮含量与对照相比也显著增加, 兰箭1号植株全氮含量分别增加了75%、34%和25%, 兰箭2号植株全氮含量分别增加了69%、42%和47%, 兰箭3号分别增加了78%、56%和37%。

图5 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种固氮酶活性的影响Fig.5 Effects of different strains on nitrogenase activity of Vicia sativa

图6 不同根瘤菌菌株对箭筈豌豆品种植株全氮含量的影响Fig.6 Effects of different strains on plant total nitrogen content of Vicia sativa

3 讨论与结论

研究结果表明, 接种有效根瘤菌菌株可增加箭筈豌豆根瘤数量和根部的固氮量。而用于本研究的3株根瘤菌菌株, 都可与3个箭筈豌豆品种进行共生匹配、结瘤固氮, 但固氮结瘤能力和对促进植物生长的作用却存在差异, 其中以菌株CCBAU01069的接种效果为最佳。接种后箭筈豌豆植株株高、根长、单株根瘤数、根瘤重、植株全氮含量以及固氮酶活性均显著高于其它处理, 初步筛选为箭筈豌豆的最佳匹配菌株。在同一低氮条件下, 3株根瘤菌菌株并不能使同一箭筈豌豆品种获得相同的接种效果, 从接种后箭筈豌豆的生长效应(单株株高、根长)、固氮效应(平均根瘤数、根瘤重)、植株全氮含量以及固氮酶活性指标来看, 同一箭筈豌豆品种分别接种3种根瘤菌后, 两者之间存在着一种最佳相互匹配的关系, 这样才可获得最佳固氮效果, 在马晓彤[19]的研究中也有相似的结果。在不接菌处理中也有根瘤的形成, 但与各处理相比数量差异较大, 可能是箭筈豌豆种子自身携带根瘤菌, 还需进一步试验证明。

在研究过程中, 所用蛭石全经过高温灭菌处理, 对植物氮素的供给量几乎为零, 仅起支持及固定植物的作用, 因此植物在生长期间所需的氮素养分, 除来源于定期加入的适量低氮营养液以外, 其它氮素养料应全靠根瘤固氮所获得。未接种根瘤菌的植物结瘤量稀少, 含氮量低, 分枝少与接种处理后的相比差异明显。由此说明在氮素营养不足的情况下接种根瘤菌是非常有必要的, 在农业可持续发展中是一种非常经济有效的措施。根瘤菌筛选的最终目的都要用于农业生产, 因此在筛选过程中不仅局限于温室考虑与寄主植物的相互匹配, 还要考虑与种植生态环境匹配性[20], 可扩大选种范围。而本研究收集的菌株种类少, 寄主单一, 因此下一步试验应在本研究的基础上中扩大菌种范围, 并结合箭筈豌豆推广种植范围的生态环境进行大田筛选, 为箭筈豌豆接种根瘤菌技术的大力推广提供依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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