线粒体与种子老化的关系
朱艳乔, 闫慧芳, 夏方山, 陈泉竹, 王明亚, 毛培胜
中国农业大学动物科技学院草业科学系,草业科学北京市重点实验室,北京 100193
毛培胜(1970-),男,内蒙古锡林浩特人,教授,博士,主要从事牧草种子生理与良种繁育研究。E-mail:maops@cau.edu.cn

第一作者:朱艳乔(1989-),女,江苏徐州人,在读硕士生,主要从事牧草育种与良种繁育。E-mail:13641027552@163.com

摘要

种子作为最基本的生产资料,其活力高低直接关系到农业生产的成败。关于种子老化机理的研究是种子科学研究的热点和难点。线粒体是真核生物细胞内重要的细胞器,是细胞能量合成和物质代谢的中心,也是活性氧产生的主要位点,且普遍认为,活性氧是导致种子老化的主要因素。种子老化过程中线粒体的典型结构逐渐被破坏,呼吸速率和氧化磷酸化效率降低,抗氧化功能发生改变,因此,本文主要概述种子的老化与线粒体结构、呼吸作用、抗氧化系统变化的关系,并阐述线粒体与细胞程序性死亡关系的研究进展,系统分析种子老化与线粒体变化研究中存在的问题及未来发展趋势,以期为研究种子老化的线粒体作用机理提供理论基础。

关键词: 种子老化; 线粒体; 活性氧; 细胞程序性死亡
中图分类号:S330.3 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)2-0290-09 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0335
The relationship between mitochondria and seed aging
Zhu Yan-qiao, Yan Hui-fang, Xia Fang-shan, Chen Quan-zhu, Wang Ming-ya, Mao Pei-sheng
Department of Grassland Science, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing Key Laboratory of Grassland Science, Beijing 100193, China
Corresponding author: Mao Pei-sheng E-mail: maops@cau.edu.cn
Abstract

Seeds vigor is very important for agricultural production as the most basic materials which directly determine the success or failure of agricultural production. The studies of seed aging mechanism are always the hotspot and difficulty in seed science research. Mitochondria are important organelles in eukaryotic cells and play central roles in cell energy synthesis and metabolism, but they are also the main sources of reactive oxygen species which have been widely regarded as the major cause of seed ageing. During seed aging, the typical structure of mitochondria is gradually damaged, accompanied by the reduction of respiratory rate and oxidative phosphorylation efficiency and the change of antioxidant function. The present article mainly summarizes the changes of mitochondrial structure, respiration, antioxidant system during seed aging, and introduces the research progress of relationship between mitochondria changes and programmed cell death. The existing problems and future development of the relationship between seed aging and mitochondria are systematically reviewed which might provide a theoretical foundation for the mechanism study of mitochondria changes during seed ageing.

Keyword: seed aging; mitochondria; reactive oxygen species; programmed cell death

种子的老化是一个循序渐进的过程, 通常是先发生生物化学变化, 然后是生理变化[1]。生物化学变化包括膜脂过氧化、抗氧化系统平衡被打破、劣变产物积累和酶活性的变化等, 而生理变化通常表现为呼吸代谢失调、合成能力下降和激素变化等[2, 3, 4, 5]。早期的研究认为, 活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的累积是造成种子老化的主要因素, ROS可以损伤蛋白质和核酸并启动不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应[6], 但到目前为止, ROS与种子老化的具体机理仍不清楚。Miquel等[7]于1980年提出了衰老的线粒体学说, 该学说将线粒体、ROS和衰老联系到一起。Berjack和Villiers[8]认为, 种子老化时首先出现线粒体的损伤。线粒体的电子传递链是种子内源性ROS产生的主要部位, 种子在老化过程中线粒体ROS的生成量增加, 造成细胞内生物大分子的氧化损伤, 引起细胞功能异常, 最终加速种子的衰老[9]。线粒体是真核生物细胞内重要的细胞器, 主要功能是通过氧化磷酸化合成ATP, 是细胞能量合成和物质代谢的中心。研究表明, 线粒体在细胞内还参与许多重要的生理过程, 如调控细胞的生长、分化, 参与种子萌发过程中叶酸的生成和精氨酸酶的表达[10], 参与细胞凋亡和信号转导等。因此, 开展关于线粒体与老化关系的研究, 对揭示种子的老化机理及种质资源的长期保存具有重要意义。本文介绍种子老化与线粒体结构、呼吸作用、抗氧化系统变化的关系及线粒体与细胞程序性死亡关系的研究进展, 并讨论种子老化与线粒体未来研究的发展趋势。

1 线粒体结构变化与种子老化

干种子细胞中的线粒体是低分化的细胞器, 虽有双层膜结构, 但嵴少, 基质稀, 内部结构难以辨识[11, 12, 13]。低分化的线粒体可以在萌发期间得到逐步的发育和修复, 形成具有典型结构的成熟线粒体[14]。从干种子中可以分离得到两种结构不同的线粒体, 即轻型线粒体和重型线粒体。有研究表明, 重型线粒体是可以进一步发育成成熟线粒体的前线粒体, 而轻型线粒体在萌发过程中逐渐解体[15]。Xin等[16]的研究发现, 线粒体结构的变化抑制种子吸胀期间线粒体的生物发生。种子在老化过程中, 线粒体膜遭到破坏, 嵴逐渐消失, 基质变稀, 并且内膜和外膜的完整性受逆境或老化的影响首先被破坏[17]。花生(Arachis hypogaea)种子老化过程中, 胚根细胞中线粒体的结构较早出现损伤, 膜及嵴的裂解随着种子吸胀时间的延长而越来越严重[18]。大豆(Glycine max)种子在22 ℃恒温条件下吸胀24 h时, 胚轴线粒体中具有大量发育良好的嵴和清晰可辨的内外膜, 而受冷害胁迫时胚轴线粒体数量减少, 内部结构发生改变[19]

种子的基因型决定了种子的潜在寿命, 而种子活力的保持取决于种子的贮藏条件, 高温高湿可以加快种子老化, 不同老化程度的线粒体出现不同的结构变化。小麦(Triticum aestivum)种子在4种温湿条件下分别储藏150 d, 在低温低湿(15 ℃、50%)条件下储藏的种子线粒体数量丰富, 呈规则的圆形或卵圆形, 具有清晰的双层膜结构, 内膜上具有丰富的嵴。随着储藏温度和湿度的增加, 种子的老化程度加深, 线粒体数量和内膜上嵴的数量减少, 双层膜结构破坏。而在高温高湿(35 ℃、85%)条件下的种子线粒体数量明显减少, 多数线粒体内部降解严重, 双层膜结构已无法辨识, 有的线粒体出现完全空泡化[20]。这些变化情况和Yan 等[21]对不同老化条件下老芒麦(Elymus sibiricus)种胚线粒体的超微结构变化结果相似; 含水量分别为4%、10%和16%的老芒麦种子在45 ℃条件下老化2 d, 随着含水量的增加, 线粒体嵴变少, 高含水量的老化种子线粒体也出现空泡化(图1)。Wang等[22]利用激光扫描共聚焦显微技术观察不同老化程度榆树(Ulmus pumila)种子线粒体的结构变化, 并根据结构的变化情况将线粒体分为4类:点状线粒体、蠕虫状线粒体、巨型线粒体和弥散线粒体; 未老化高活力种子中线粒体的典型结构为点状, 并均匀地分散在细胞质中; 老化2 d后出现明显伸长并聚集的蠕虫状线粒体, 老化3 d的种子中出现巨型线粒体, 巨型线粒体的体积显著增大并进一步聚集, 嵴的数量减少, 而弥散线粒体聚集到细胞膜处, 只能观测到微弱的荧光。

图1 不同含水量老芒麦种子老化后的种胚线粒体超微结构图[21]Fig.1 Ultrastructure of embryo mitochondria of aged Elymus sibiricus seeds with different seed moisture contents[21]

线粒体的形态结构与功能密切相关, 完整的内外膜、发育完好的嵴和浓稠的基质是线粒体进行TCA循环和高效氧化磷酸化的前提[17]。种子的老化抑制线粒体在萌发阶段的正常发育, 线粒体形态结构发生改变, 缺乏有效的TCA循环和氧化磷酸化, 导致ATP的供应量不足, 线粒体氧化磷酸化的受限又会促进ROS生成量的增加, 反过来促进种子老化。

2 线粒体呼吸作用的变化与种子老化

种子的萌发是个需能过程, 线粒体是种子代谢产生能量物质ATP的主要场所。种子在老化过程中, 线粒体数目减少, 呼吸作用减弱, ATP合成量减少, 从而使幼苗生长速度和整齐度下降。与新收获的大豆种子相比, 储藏3年的大豆种苗胚轴中线粒体的数目与线粒体的氧化磷酸化效率显著降低[23]。老化显著降低线粒体电子传递链的电子传递效率, 使基于底物NADH和琥珀酸的呼吸速率和呼吸控制比(Respiratory Control Ratio, RCR)降低, ATP的供应量不足[15]。Ferguson等[24]发现, 大豆种子在老化初期, 呼吸状态3的呼吸速率和RCR降低, RCR的降低表明线粒体内的氧化磷酸化效率降低。ATP是生命活动的直接能量来源, 种子老化导致ATP的供应能力减弱。高生活力的花生种子ATP含量显著高于低生活力的种子[25]。种子经自然老化或人工老化后, ATP含量下降[26]。经控制劣变的向日葵(Helianthus annuus)种子也出现类似现象, ATP含量和能荷均降低[27]。线粒体的老化通常导致耗氧速率下降, 老化后种子在吸胀期间O2的吸收速率表现为下降趋势[28]。细胞色素氧化酶(COX)和苹果酸脱氢酶(MDH)是线粒体的标志酶, 种子老化过程中COX和MDH活性逐渐降低, 线粒体呼吸受阻[16, 28]。COX活性的降低会增加线粒体电子传递链的还原性, 使电子漏和ROS含量增加[6]

种子在萌发过程中存在多条呼吸途径, 包括细胞色素途径、交替途径和解偶联途径等。种子在老化或逆境条件下, 通过调节3种呼吸途径以平衡ATP水平和ROS生成速率。细胞色素途径中存在3个能量贮存位点, 分别位于复合体Ⅰ 、Ⅲ 、Ⅳ 中, 这3个位点可以泵出质子并产生ATP。外源NADP中的电子传递不经过位于复合体Ⅰ 中的质子泵出位点而直接把电子传给泛醌, 这是外源NADP和内源NADP的电子传递差别。交替途径中电子经过泛醌传递给交替氧化酶系统进而传递给O2, 外源NADP经过该途径传递电子不产生ATP, 内源NADP可以产生一个ATP。解偶联途径中的解偶联蛋白是植物线粒体的离子载体蛋白[29], 可以将H+运回线粒体基质, 破坏膜电势, 不产生ATP。种子的发育和萌发过程都是处在相对缺氧的环境中, 但发育中的种子存在叶绿体, 可以进行光合作用并释放O2, 缓解O2对呼吸的限制[30]。有研究表明, 萌发期种子内的缺氧环境有利于促进NO的生成, 从而抑制呼吸的细胞色素途径, 而交替途径又称抗氰呼吸, 对氰化物的抑制不敏感。在萌发期受盐胁迫的小麦和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)种子中加入外源NO, 种子中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子( O2-)的释放速率降低, 抗氧化酶系统活性增加[31, 32]。线粒体内的交替氧化酶和解偶联蛋白都耗散自由能而生成热能, 减少ATP和ROS的生成, 维持细胞内的能量平衡, 增加植物的抗逆性。但交替氧化酶作为连接泛醌和分子氧的桥梁不受质子梯度势能的调控, 其参与电子传递的前提条件是线粒体内具有较高的泛醌还原水平, 而解偶联蛋白在相对较低的泛醌还原水平上也可以发挥作用, 促进电子的高效传递[33]

3 线粒体活性氧的产生、清除系统与种子老化

植物种子细胞内ROS的产生主要来源于线粒体、过氧化物酶体和NADPH脱氢酶系等, 其中约有90% ROS的产生可追溯到线粒体[34]。通常认为, ROS的积累是导致种子老化的主要原因之一。植物线粒体内的ROS主要包括 O2-、H2O2等, ROS可以作为强氧化剂攻击细胞膜系统和生物大分子物质核酸、蛋白质等, 造成氧化损伤[35, 36]。种子在老化过程中积累的ROS可以引发线粒体膜中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用, 破坏膜的完整性, 使线粒体发生膨胀[37], 增加线粒体的电子漏, 反过来促进ROS积累量的进一步增加。线粒体内膜的完整性有利于维持内膜两侧的跨膜电势, 对氧化磷酸化生成ATP至关重要[38]。脂质过氧化产物MDA也能对细胞产生直接的毒害作用, 加快种子的老化[39, 40]。ROS攻击蛋白质多肽链上的氨基酸残基, 使蛋白质分子发生交联、聚合、断裂等氧化损伤, 导致蛋白质一级结构发生改变, 蛋白质功能和理化性质受到影响[41]。线粒体DNA不像细胞核DNA有核膜保护, 它易受ROS攻击而产生基因序列改变、基因突变, 引发细胞衰老。

植物种子线粒体的呼吸链上包括4个复合体, 即复合体Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅵ , 通常认为复合体Ⅰ 和Ⅲ 是产生ROS的主要位点。在电子传递过程中, 位于复合体Ⅰ 中的黄素蛋白、铁硫中心和游离于复合体Ⅰ 、Ⅲ 之间的醌、半醌发生氧化还原的能障较低, 可以直接启动O2的单电子还原反应, 产生 O2-[42-43]。Boveris等[44]利 用离体线粒体的亚线粒体成分研究 O2-的生成, 发现还原型醌(CoQH2)与O2反应生成 O2-:即反应CoQH2+O2→ CoQH· +H++ O2-; CoQH· +O2→ CoQ+H++ O2-, O2-在超氧化物歧化酶作用下生成H2O2。大豆种子随着老化时间的延长, O2-的产生速率和H2O2的含量表现为先增加后降低的趋势, 只是H2O2的含量达到峰值时间较 O2-的产生速率峰值时所需时间出现延迟[16, 45]。人工老化的大葱(Allium fistulosum)种子随着老化程度加深, 自由基和H2O2含量出现增加的趋势[46]

植物种子线粒体内拥有一套降低或清除ROS的抗氧化系统, 由酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统组成, 酶促抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHR)和谷胱甘肽还原酶(GR), 非酶促抗氧化系统主要包括抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)。通常认为, SOD是生物防御ROS攻击的第一道防线。现已发现真核细胞内存在两种形式的SOD, 分别定位于细胞质基质和线粒体基质中的Cu-SOD和Mn-SOD, 这两种形式的SOD都可以催化 O2-发生歧化反应, 将 O2-转化为H2O2O234。Jimenez等[47]于1997年首次在豌豆(Pisum sativum)叶片细胞线粒体中证明有完整的抗坏血酸-谷胱甘肽循环的存在(图2), AsA作为一种重要的自由基清除剂[48, 49], 在APX的催化下将H2O2还原成H2O, 而AsA被氧化成脱氢抗坏血酸(DHA), DHA通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环重新被还原成AsA, 从而调节线粒体自身的H2O2浓度。正常生理条件下, 线粒体内ROS的产生和清除处于动态平衡, 并不会造成氧化损伤, 但种子受低含水量的限制, 抗氧化酶活性难以发挥, 不能有效移除ROS, 在这期间, 清除ROS的任务主要由AsA和GSH承担。大豆种子人工加速老化后, SOD、APX、MDHAR、GR活性和AsA、GSH含量降低, 而DHAR活性降幅较小, 在老化初期基本保持不变, 表明DHAR在H2O2的清除和AsA的再生过程中的起到重要作用[45]

图2 抗坏血酸-谷胱甘肽循环[47]Fig.2 The ascorbic acid-glutathione cycle in mitochondrial[47]

4 线粒体与细胞的程序性死

细胞程序性死亡(Programmed Cell Death, PCD)也称细胞凋亡, 是指细胞在发育过程中或某些环境因素刺激下, 由基因控制的、主动的细胞死亡过程[50, 51]。线粒体与细胞程序性死亡关系的研究主要集中在动物中, 在植物中的研究起步较晚, Greenberg[50]于1996年最早提出在植物中同样存在PCD, 近年来的诸多研究表明, 种子活力的丧失和PCD有紧密的关系。控制劣变的榆树种子、向日葵种子发生了和动物细胞中类似的凋亡事件, 包括DNA laddering、TUNEL阳性反应、细胞色素c的释放、类半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3-like)含量的增加[22, 52]。植物种子在劣变过程中发生线粒体跨膜电势(Δ Ψ )、线粒体膜通透性转运孔(Mitochondrial Membrane Permeability Transition Pore, MPTP)、电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent Anion Channel, VDAC)的改变[22], 这些改变是引发PCD的重要因素, 表明线粒体在植物种子PCD中的重要作用。

线粒体参与PCD主要通过3条信号转导通路:外源性通路、内源性通路和内质网通路。线粒体膜通透性转运孔复合体假说认为, 不同PCD通路都是通过作用于线粒体膜进一步引发PCD[53]。线粒体可感受到凋亡信号, 受诱发释放细胞色素c等凋亡诱导因子, 释放到细胞中的细胞色素c及其它凋亡诱导因子通过一系列反应激活Capase-3-like等酶系或抑制细胞内抗凋亡蛋白导致细胞凋亡。MPTP的开放可以使分子量小于1.5 kD的物质通过线粒体膜[54], 水分子的渗入使线粒体肿胀, 线粒体内膜拥有足够面积适应体积的膨胀, 线粒体外膜抗膨胀能力有限, 最终因内膜的膨胀导致外膜的破裂[55, 56]。正常MPTP周期性开放, 并与Δ Ψ 的稳定密切相关; 周期性开放的MPTP可以维持线粒体的内稳态, 但MPTP持续开放会导致Δ Ψ 的降低或是完全崩解。Δ Ψ 是线粒体氧化磷酸化生成ATP的驱动力, 同时也是核基因编码的线粒体蛋白跨线粒体内膜进入线粒体的动力, Δ Ψ 的崩解导致线粒体功能的缺失、活性氧和凋亡小体等的释放, 是细胞凋亡的一个特异性早期指标。同时, Δ Ψ 崩解时线粒体释放凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor, AIF), AIF不需要其它辅助因子的参与可直接诱发细胞核凋亡。VDAC是由核基因编码的定位于线粒体外膜的孔道蛋白[57], 是线粒体和细胞质之间进行能量代谢物质如苹果酸盐、丙酮酸盐、ADP、ATP等交换的必经通道。在正常的低电压情况下, VDAC开放, 优先选择ADP、ATP等阴离子; 当电压突然降低或升高时, VDAC关闭, 并且具有阳离子选择性, 阻断ATP 等代谢产物的转运[58]。因此, VDAC的异常会使线粒体功能紊乱, 导致ATP的合成和转运受阻、Δ Ψ 下降和细胞色素c等的释放。研究表明, ROS是诱发PCD的关键调制器(图 3)。烟草(Nicotiana tabacum)细胞在高温诱导PCD过程中发生 O2-和H2O2的爆发, 而通过AsA和SOD预处理后, 细胞的死亡率由50%分别降到10%和20%[59]。Wang等[22]的研究表明, 榆树种子中线粒体通透性转运孔的组分如VDAC、亲环素D(cyclophilin D)的表达量与ROS生成量呈正相关, 且MPTP的不正常开放可以被AsA和环孢霉素A(CsA)有效地缓解。在动物中, 细胞的凋亡是由一类高度保守的Capases酶类介导的, 而在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因组中并没有编码Capases酶类的基因, 而是依靠具有Capases酶类活性的其它类型蛋白酶[60]。种子控制劣变过程中释放的细胞色素c含量和Capase-3-like活性的增加可以通过AsA和CsA处理而得到抑制[52]

图3 活性氧引发种子老化过程依赖于线粒体的细胞程序性死亡模型[22]Fig.3 Model for ROS provoked mitochondria-dependent cell death during aging[22]

关于植物PCD机理的研究尚处于初步阶段, 尽管动物和植物在PCD过程中主要特征相同、机制相似, 但植物PCD有其独特的特征和机制, 如在植物细胞中至今尚未发现编码caspase基因的存在。植物种子中同样也存在PCD, 种子PCD机理的研究对种子的抗逆性的提高和种质资源的保存具有重要意义。

5 展望

在近半个世纪以来, 种子线粒体与老化关系的研究已取得较大的进展。目前, 普遍认为种子线粒体在老化过程中起到重要作用。因此, 有必要进一步针对以下问题开展研究, 以推进种子老化机理的发展, 并增加对老化机理的认识。

种子在老化过程中, 线粒体结构和功能发生相应的变化, 但目前关于线粒体结构和功能的研究较为独立, 二者的关系尚不明确, 不同结构的线粒体功能发生了怎样的变化?这种功能上的变化与线粒体结构的变化有何联系?这是在今后的研究中需要解决的问题之一。

线粒体是ROS产生的主要位点, 其清除依赖线粒体内的抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环。种子老化过程中AsA-GSH循环被打破, 促进了ROS的积累。外施抗氧化剂AsA、GSH、维生素E、水杨酸、褪黑素等可以在一定程度上修复老化对种子造成的损伤, 提高种子的活力。但抗氧化剂在线粒体水平上修复机理尚不清楚, 有待进一步研究探讨。

线粒体与细胞凋亡关系的研究是当今生命科学研究的前沿。植物种子和其它器官一样, 都存在PCD现象。近些年, 榆树劣变种子线粒体研究中, 线粒体膜通透性转运孔的存在和开放证明了种子PCD现象。关于种子线粒体与细胞凋亡的研究仍处于初步阶段, 开展对细胞色素c、Δ Ψ 和线粒体膜通性转运孔等在种子细胞PCD过程中的具体机理的研究, 有利于延缓和预测种子老化, 为种质资源的长期保存提供技术方法。

蛋白质组学的迅速发展推动着线粒体蛋白质组学的研究。线粒体蛋白质组学在植物中的研究起步较晚, 在种子中的研究甚少, 而且多集中在一些模式植物拟南芥和水稻(Oryza sativa)中。利用蛋白质组学研究种子线粒体与老化的关系, 从分子角度探究种子老化的机理, 是未来种子老化机理研究的发展方向。由于线粒体分离、纯化技术的局限, 线粒体数据库的贫乏, 种子线粒体蛋白质组学研究仍需进一步探索。

The authors have declared that no competing interests exist.

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