引用本文
侯建建, 白春生, 张庆, 玉柱. 单一和复合乳酸菌添加水平对苜蓿青贮营养品质及蛋白组分的影响. 草业科学, 2016,33(10):2119-2125
Hou Jian-jian, Bai Chun-sheng, Zhang Qing, Yu Zhu. Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa. Pratacultural Science,2016,33(10): 2119-2125  
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《草业科学》编辑部
单一和复合乳酸菌添加水平对苜蓿青贮营养品质及蛋白组分的影响
侯建建1, 白春生2, 张庆3, 玉柱1
1.中国农业大学动物科技学院,北京 100193
2.沈阳农业大学园艺学院,辽宁 沈阳110866
3.华南农业大学林学与风景园林学院,广东 广州 510642
玉柱(1963-),男(蒙古族),内蒙古通辽人,教授,博士,主要从事饲草加工贮藏与利用研究。E-mail:yuzhu3@sohu.com

第一作者:侯建建(1992-),男,河南舞阳人,在读硕士生,主要从事饲草加工研究。E-mail:819331877@qq.com

收稿日期: 2016-06-14
基金: 国家牧草产业技术体系(CARS-35)公益性行业(农业)科研专项(201303061)天津市农业科技成果转化与推广项目(201404040)内蒙古自治区科技计划项目“苜蓿混合青贮调制技术研究与示范”
摘要

以第1茬现蕾期刈割的紫花苜蓿( Medicago sativa)为原料(干物质含量为42.56%),结合康奈尔碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS),研究不同浓度的单一和复合乳酸菌对苜蓿青贮品质及蛋白组分的影响。发酵40 d后取样分析其青贮发酵品质和营养成分,结果表明,所有乳酸菌处理组都能显著降低苜蓿青贮饲料的氨态氮含量( P<0.05),并且均未检测到丁酸;添加量为1×107 cfu·g-1的单一乳酸菌处理组氨态氮含量最低,乳酸含量最高;除添加量为1×105 cfu·g-1的复合菌处理组外,其它乳酸菌处理组的pH均显著低于无添加剂处理组( P<0.05);乳酸菌处理后粗蛋白含量无显著变化( P>0.05);复合菌处理组的非蛋白氮含量显著低于无添加剂处理组( P<0.05);单一和复合乳酸菌都能降低蛋白组分中的非蛋白氮(PA)含量,增加快速降解真蛋白质(PB1)和中速降解真蛋白质(PB2)含量,复合菌处理的真蛋白质(PB)含量显著高于对照的( P<0.05)。综上所述,高浓度的单一植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum)处理的苜蓿青贮发酵品质最好,复合菌能保护更多的真蛋白不被降解。

关键词: 紫花苜蓿; 乳酸菌; 青贮品质; 蛋白组分
中图分类号:S816.11 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)10-2119-07 doi: :10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0725
Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa
Hou Jian-jian1, Bai Chun-sheng2, Zhang Qing1, Yu Zhu1
1.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 10019, China
2.College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
3.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Corresponding author:Yu Zhu E-mail:yuzhu3@sohu.com
Abstract

The objective of this study was to determine the effects of applying single or multiple lactic acid bacteria (LAB) at ensiling on the fermentation quality and protein fractions of alfalfa ( Medicago sativa). The protein fractions of alfalfa silage were calculated by Cornell net carbohydrate and protein system (CNCPS). The silage material was the first-cut alfalfa (425.6 g DM·kg-1 fresh herbage) harvested at budding stage. Forage was packed into 21 laboratory silos and ensiled for 40 days. The results showed that all treatments with LAB had significantly lower ( P<0.05) concentration of NH3-N than untreated group, and butyric acid was not detected in these treatments. The treatment of single-strain ( Lactobacillus plantarum) at 1×107 cfu·g-1 fresh herbage had the lowest concentration of NH3-N and the highest concentration of lactic acid. Silages treated with lactic acid bacteria (other than multi-strains at 1×105 cfu·g-1 fresh herbage) characterized by lower ( P<0.05) pH value. There was no ( P>0.05) treatment effect on the content of crude protein. The content of non-protein nitrogen (NPN) in silages with all additives of LAB was reduced when compared with untreated, and silages treated with compound LAB characterized by lower ( P<0.05) NPN. Additives with single and multi-strains of LAB both resulted in alfalfa silage with low concentration of non-protein nitrogen (PA), high concentration of immediately degraded protein (PB1) and intermediately degraded protein (PB2). The concentration of true protein (PB) in silage with multi-strains of LAB was higher ( P<0.05) than untreated. Therefore, high concentration of L. plantarum was beneficial to improve the fermentation quality of alfalfa, and the proteolysis, in some extent, could be inhibited by multiple LAB at ensiling.

Keyword: alfalfa; lactic acid bacteria; silage quality; protein fractions

紫花苜蓿(Medicago sativa)素有“ 牧草之王” 的美称。苜蓿青贮可以解决其在调制干草过程中叶片脱落和雨淋造成的营养物质损失, 并且具有柔软多汁、气味芳香、适口性好的特点。但是, 由于苜蓿可溶性碳水化合物含量低, 具有较强的缓冲能力, 因此不宜单独青贮[1]。在苜蓿青贮中添加乳酸菌, 如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum), 能够加快发酵速度, 增加乳酸含量, 降低pH和氨态氮含量, 提高青贮发酵品质[2, 3, 4, 5, 6, 7]。而且有研究报道, 干酪乳杆菌(L. casei)能显著提高苜蓿青贮发酵品质[8]。但是植物乳杆菌和干酪乳杆菌复合添加是否比单一处理效果更好尚未见报道。

对于豆科牧草特别是紫花苜蓿, 青贮过程中蛋白质会降解产生大量的非蛋白氮(PA), 与蛋白氮相比, 青贮饲料中的非蛋白氮不能被家畜有效利用, 大部分氮以尿素的形式排出体外, 进而降低优质蛋白牧草氮的利用率[9]。相关研究表明, 甲酸和甲醛能够抑制苜蓿青贮过程中的蛋白质降解[10, 11], 植物乳杆菌能保存更多的真蛋白质(PB)[5], 而干酪乳杆菌与植物乳杆菌复合处理对苜蓿青贮过程中蛋白降解的抑制效果还未见报道。康奈尔碳水化合物-蛋白质体系(Cornell net carbohydrate and protein system, CNCPS)是继饲料概略养分分析(Weende)和范式洗涤纤维(Van Soest)体系之后, 充分考虑瘤胃降解特征的饲料评价体系[12]。因此, 本研究设置不同浓度单一和复合乳酸菌, 并结合CNCPS中蛋白质组分划分的方法, 分析探讨单一植物乳杆菌和复合菌(植物乳杆菌+干酪乳杆菌)对苜蓿青贮发酵品质及其蛋白组分的影响。

1 材料与方法
1.1 青贮原料与乳酸菌

青贮原料为安徽蚌埠秋实草业种植的第1茬维斯顿紫花苜蓿, 现蕾期刈割, 用铡草机铡至2~3 cm, 适度晾晒至水分约为60%, 茎叶混合均匀。经测定, 原料干物质含量为42.56%, 粗蛋白含量为21.46%, 中性洗涤纤维含量和酸性洗涤纤维含量分别为36.21%和23.24%, 水溶性碳水化合物含量为4.88%, 非蛋白氮含量为6.02%。植物乳杆菌和干酪乳杆菌均由中国农业大学草地研究所牧草青贮实验室提供。

1.2 青贮处理

本试验设置3个不同浓度的植物乳杆菌和3个不同浓度的植物乳杆菌与干酪乳杆菌的复合菌, 对照组不使用任何添加剂(表1)。每个处理3个重复, 分别装入0.5 L白色塑料罐中, 压实密封, 室温保存。

表1 苜蓿青贮处理 Table 1 The treatments of alfalfa silage
1.3 测定指标和方法

发酵40 d后打开青贮罐, 将青贮料取出, 充分混匀, 称取20 g青贮料, 加入180 mL蒸馏水, 用九阳榨汁机搅碎1 min, 先后用4层纱布和定性滤纸过滤, 得到青贮饲料浸提液, 于-20 ℃下保存, 用于pH、乳酸、挥发性脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)及氨态氮(NH3-N)的测定; 剩余青贮料于65 ℃下烘干48 h, 用植物粉碎机粉碎过0.425 mm孔径筛后, 收集保存, 用于测定干物质(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、非蛋白氮(NPN)、可溶性蛋白(SOLP)、中性洗涤不溶蛋白(NDIP)和酸性洗涤不溶蛋白(ADIP)。

1.3.1 感官评价 青贮灌打开后, 从青贮饲料的气味、色泽和质地等3个方面进行评价[1]。

1.3.2 发酵指标 pH用雷磁PHS-3C型pH计测定; 乳酸和挥发性脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)采用 SHIMADZE-10A型高效液相色谱仪分析, 色谱柱为ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column 300 mm× 8 mm, 检测器为SPD-M10AVP, 流动相为3 mmol· L-1高氯酸, 流速1 mL· min-1, 进样量5 μ L, 柱温50 ℃, 检测波长210 nm[13]; NH3-N采用苯酚-次氯酸比色法测定[14]。

1.3.3 营养成分 DM采用烘干法测定[15]; CP采用凯氏定氮法测定[15]; NDF和ADF采用Van Soest法测定[15]。NPN采用钨酸溶解法测定[16]; SOLP采用硼酸-磷酸缓冲液法测定[16]; NDIP用中性洗涤纤维测定后的滤袋测定[16]; ADIP用酸性洗涤纤维测定后的滤袋测定[16]; 水溶性碳水化合物(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法测定[15]。未经过青贮处理的青贮原料同样于65 ℃下烘干48 h, 用植物粉碎机粉碎过0.425 mm孔径筛后, 收集保存, 对其营养物质进行测定。

1.3.4 CNCPS蛋白组分计算方法[17]

PA (% CP)=NPN(% CP);

PB1(% CP)=SOLP(% CP)-PA(% CP);

PB3(% CP)=NDIP(% CP)-ADIP(% CP);

PC (% CP)=ADIP(% CP);

PB2(% CP)=100-PA(% CP)-PB1(% CP)-PB3(% CP)-PC(% CP);

PB (% CP)=PB1(% CP)+PB2(% CP)+PB3(% CP).

式中:PA、PB、PB1、PB2、PB3和PC分别为CNCPS蛋白质组分中的非蛋白氮、真蛋白质、快速降解真蛋白质、中速降解真蛋白质、慢速降解真蛋白质和结合蛋白质。% CP代表各组分占粗蛋白的百分比。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0进行单因素方差分析, 用Duncan法(显著水平为0.05)进行两两比较, 结果用均值和标准差表示。

2 结果与分析
2.1 对苜蓿青贮发酵品质的影响

青贮发酵40 d后, 打开苜蓿青贮罐, 观察到添加乳酸菌的苜蓿青贮饲料均手感松软、色泽亮黄、有酸香味, 而对照组色泽稍暗, 有略微刺鼻味。

同对照相比, 乳酸菌处理组的氨态氮占总氮的比(简称氨态氮)均显著降低(P< 0.05), 其中LP7处理组氨态氮含量最低, 并且乳酸菌处理组均未检测出丁酸(表2)。除LP5+LC5处理组外, 其它乳酸菌处理组的pH均显著低于对照组的(P< 0.05); 单一菌LP5和LP6处理组的pH分别显著低于复合菌LP5+LC5和LP6+LC6处理组和(P< 0.05), LP7处理组的pH也低于复合菌LP7+LC7处理组, 但差异不显著(P> 0.05)。最高浓度乳酸菌处理组的氨态氮含量显著低于最低浓度乳酸菌处理组的(P< 0.05)。LP5+LC5处理组的乳酸含量显著低于对照组的(P< 0.05), 其它乳酸菌处理组的乳酸含量与对照之间差异不显著(P> 0.05), 复合菌LP5+LC5和LP7+LC7处理组的乳酸含量显著低于单一菌处理组的(P< 0.05), 其中LP7处理组乳酸含量最高。不同处理之间乙酸含量无显著差异(P> 0.05), 复合菌处理组的乙酸含量略低于单一菌处理组的。复合菌处理组的丙酸含量低于单一菌处理的, 其中LP5+LC5处理组的丙酸含量显著低于单一菌LP5处理组的(P< 0.05)。丁酸只在对照组中检测出。

表2 苜蓿青贮饲料的发酵品质 Table 2 The fermentation quality of alfalfa silage
2.2 对苜蓿青贮营养成分的影响

乳酸菌处理组与对照组之间干物质和粗蛋白含量无显著差异(P> 0.05); 单一菌处理组的粗蛋白含量略高于复合菌处理组的, 其中, LP6处理组的粗蛋白含量显著高于LP6+LC6处理组(P< 0.05)(表3)。乳酸菌处理后中性和酸性洗涤纤维含量均增加, 其中LP7处理组的中性和酸性洗涤纤维含量显著低于LP5处理组的(P< 0.05), LP7+LC7处理组的中性洗涤纤维含量显著低于LP5+LC5处理组的(P< 0.05)。与对照相比, 所有乳酸菌处理组的非蛋白氮含量均降低, 其中复合菌处理组的非蛋白氮含量显著低于对照组的(P< 0.05), 其中LP7+LC7处理组的非蛋白氮含量最低。

表3 苜蓿青贮饲料的营养成分 Table 3 The chemical components of alfalfa silage
2.3 对苜蓿青贮CNCPS蛋白组分的影响

对照组的PA含量显著高于LP7、LP5+LC5和LP7+LC7处理组的(P< 0.05); 相反, 对照组的PB含量显著低于LP7、LP5+LC5和LP7+LC7处理组的(P< 0.05); 其中, LP7+LC7处理组的PA含量最低, PB含量最高; 除LP7+LC7处理组外, 其它乳酸菌处理组的PA和PB含量之间差异不显著(P> 0.05)。所有乳酸菌处理组的PB1含量显著高于对照组的(P< 0.05), 其中复合菌LP5+LC5处理组的PB1含量显著高于单一菌LP5和LP6处理组的(P< 0.05)。LP7+LC7处理组的PB2含量最高, 且显著高于对照组、LP5和LP6+LC6处理组的(P< 0.05), 对照组PB2含量均低于乳酸菌处理组。LP6处理组的PB3含量最低, 且显著低于对照组和其它乳酸菌处理组的(P< 0.05)。除LP5+LC5处理外, 对照组的PC含量均显著低于其它处理组的(P< 0.05)(表4)。

表4 苜蓿青贮饲料的CNCPS蛋白组分 Table 4 The CNCPS protein components of alfalfa silage
3 讨论

通常情况下, 发酵品质良好时, pH为4.2或更低, 氨态氮占总氮含量小于10%, 丁酸含量小于1%[1]。豆科牧草中低水分青贮有利于青贮饲料的稳定贮藏[1]。本研究中对照组苜蓿青贮饲料的氨态氮含量小于10%, 丁酸含量也较低, 可能是因为青贮原料的DM含量为42.56%, 属于半干青贮; 乳酸菌处理后苜蓿青贮饲料的pH、氨态氮和丁酸含量降低, 说明乳酸菌在低水分的苜蓿青贮中能够进一步提高青贮发酵品质[18, 19]。本研究中高浓度植物乳杆菌处理的苜蓿青贮饲料的乳酸含量最高, 氨态氮含量最低, 同时其pH也较低, 说明植物乳杆菌作为同型发酵乳酸菌产乳酸能力较强, 在青贮中能很快降低pH, 从而抑制梭菌的生长[20, 21]; 但是同样浓度植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合后乳酸含量降低, 可能是因为复合菌处理存在异质型发酵, 产生较少乳酸。另外, 本研究中乳酸菌处理后纤维组分含量增加, 且DM含量越高其纤维组分含量有增加趋势, 可能是因为紫花苜蓿在低水分青贮时, 纤维组分更不易降解, 而添加乳酸菌消耗了更多糖类物质, 因此纤维组分含量相对增加。

相关研究表明, 青贮饲料发酵过程中蛋白质的降解是由于植物蛋白酶和微生物的作用使真蛋白被分解为肽、游离氨基酸、氨以及胺等PA的过程, 其中植物蛋白酶是造成青贮饲料蛋白质降解的主要原因[22, 23]; 微生物作用也是造成发酵饲料蛋白质降解的重要原因, 饲草青贮发酵过程中的梭菌发酵可将蛋白质分解成胺和氨气[1, 24]。此外, 发酵过程中蛋白质降解的程度与发酵饲料的pH有很大关联, 这主要是因为pH能够影响蛋白酶的活性, 且在低pH下植物蛋白酶的活性会受到抑制, 有研究表明苜蓿中蛋白酶的最适宜pH为6.0[25]。植物乳杆菌处理后苜蓿青贮饲料中的PA含量低于不处理对照, 但两者间差异不显著, 不如甲酸处理效果显著[5, 26]。本研究中植物乳杆菌单一处理的NPN含量虽有降低, 但与无添加剂对照相比, 差异不显著, 可能是因为植物乳杆菌产生的乳酸降低了青贮饲料的pH, 一定程度上抑制了植物蛋白酶的活性, 但是效果不明显。本研究还得出复合乳酸菌处理后青贮饲料中的PA含量与对照相比显著降低, 说明植物乳杆菌和干酪乳杆菌复合同时添加时, 一方面pH降低抑制了植物蛋白酶的活性; 另一方面, 复合菌可能产生了抑菌物质[27], 减弱了微生物对蛋白质的降解作用, 从而保护了更多的真蛋白质。因此, 复合菌与单一菌相比, 复合菌更能抑制苜蓿青贮过程中蛋白质的降解。此外, 非蛋白氮中的长链肽氮是瘤胃微生物合成菌体蛋白的重要底物[11], 但是本研究只是分析了青贮饲料中PA含量, 并没有对青贮饲料中的氮组分进行深入研究。

CNCPS将蛋白质划分为非蛋白氮是(PA)、真蛋白质(PB)和结合蛋白质(PC), PB又被进一步分为快速降解真蛋白质(PB1)、中速降解真蛋白质(PB2)和慢速降解真蛋白质(PB3)3部分[28]。蛋白质组分中的PA、PB1和PB2是瘤胃微生物合成自身蛋白的主要氮源, 但瘤胃微生物氮的合成效率是通过补充青贮蛋白氮而不是NPN提高的[29]。本研究中所有乳酸菌处理组的PA含量均低于对照组的, PB1和PB2含量均高于对照组的, 其中植物乳杆菌与干酪乳杆菌复合菌处理的PB1和PB2含量增加更明显, 说明复合菌能为反刍动物瘤胃提供更有效的氮源。蛋白组分中的PB3与细胞壁结合在一起, 在瘤胃中降解缓慢, 其中大部分可避开瘤胃降解进入消化道[17, 30]。因此, 本研究中一些处理组的PB3含量增加一定程度上可为反刍动物提供瘤胃非降解蛋白质(rumen undegraded protein, RUP), 其中RUP是小肠可消化蛋白质的组成部分[31]。蛋白组分中的PC含有与木质素结合的蛋白质、单宁蛋白质复合物和其它高度抵抗微生物和哺乳类酶类的成分以及美拉德产物, 在酸性洗涤剂中不能被溶解, 在瘤胃中不能被瘤胃微生物降解, 在瘤胃后消化道也不能被消化[30, 32]。因此, PC组分中的氮不能被反刍家畜利用。本研究中PC含量较低, 可能是因为现蕾期苜蓿中结合蛋白质含量较低。

此外, 研究表明青贮饲料中添加乳酸菌对反刍动物瘤胃体外发酵和微生物产量也有影响[5, 33, 34]。本研究中, 复合菌能够显著降低非蛋白氮含量, 并且复合菌处理的PB1显著增加, PB2含量也有增加趋势。因此, 在苜蓿青贮中植物乳杆菌和干酪乳杆菌复合添加可能有利于反刍动物瘤胃发酵, 但仍需进一步研究其对瘤胃微生物的影响。

4 结论

单一和复合菌处理都能够显著降低苜蓿青贮饲料的氨态氮含量和丁酸含量; LP7处理氨态氮含量最低, 乳酸含量最高; 除LP5+LC5处理组外, 其它乳酸菌处理组的pH均显著低于无添加剂对照组; 复合菌能显著降低非蛋白氮含量; 单一和复合菌都能降低苜蓿青贮饲料的PA含量, 增加PB1和PB2含量, 复合菌处理的PB含量增加更明显。综上所述, 高浓度的植物乳杆菌处理的苜蓿青贮发酵品质较好, 复合菌能保护更多的真蛋白不被降解。

The authors have declared that no competing interests exist.

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