试验地位于兰州大学草地农业科技学院庆阳试验站(35° 39' N, 107° 51' E), 该站处于黄土高原西部, 属温带大陆性季风气侯。年降水量480~660 mm, 多集中在7-9月, 年平均蒸发量1 504 mm。年平均气温8~10 ℃, 极端最高气温39.6 ℃, 极端最低气温-22.4 ℃, 年日照时数为2 300~2 700 h, 无霜期平均为161 d。土壤为黑垆土, 机械组成中粉粒含量70%, 有机质含量在1%左右, 土壤全氮含量低于0.1%, pH值为8.0~8.5^[19]。

试验地建于2001年, 轮作方式为玉米(Zea mays)-小麦(Triticum aestivum)-大豆(Glycine max)。耕作措施为:1)传统耕作(T), 每年在9月份冬小麦播种前或冬小麦收获后翻耕地表20 cm; 2)免耕(NT), 全年不耕作, 仅在播种时, 对土壤有较小的扰动; 3)传统耕作+秸秆覆盖(TS), 耕作后, 收获前茬作物, 将全部或部分秸秆还田; 4)免耕+秸秆覆盖(NTS), 免耕, 将前茬作物秸秆全部或部分还田。覆盖物采用前茬作物秸秆, 玉米的前茬是大豆, 秸秆覆盖处理为大豆收获豆荚后秸秆立茬(全部还田), 冬小麦的前茬是玉米, 50%的玉米秸秆截成小段后均匀铺撒在地表, 大豆前茬作物为冬小麦, 冬小麦收获时留30 cm左右高茬, 其它秸秆均匀铺撒在地表。每处理4个重复, 小区面积为4 m× 13 m, 完全随机区组排列。

轮作序列为春玉米-冬小麦-夏大豆。玉米于4月上旬播种(行株距38 cm), 9月中下旬收获; 玉米收获后立即播种小麦(播量187 kg· hm^-2, 行间距15 cm), 第2年6月底或7月初收获; 随后立即播种大豆(行间距25 cm), 10月收获。大豆收获后休闲至来年4月, 至此完成一个轮作循环。为使轮作的所有作物在同一年出现, 试验设2个阶段, 每2年完成一个轮作循环。

玉米和冬小麦播种前, 各施300 kg· hm^-2磷酸氢二铵(NH₄)₂HPO₃(18% N, 64% P)作为底肥, 玉米在生长期间施30 kg· hm^-2尿素(46% N)作为追肥, 冬小麦拔节期施150 kg· hm^-2尿素(46% N)作为追肥。大豆前茬作物为小麦, 小麦收获时, 覆草处理留茬30 cm左右, 于同一块地中及时播种大豆, 播前施63 kg· hm^-2 P₂O₅磷肥作为底肥。作物生长期间定期人工除草^{[26, 27]}。

第1次于2014年6月, 即夏季, 分别在4个处理样地上, 取地表5-30 cm处的土壤(每份土样2 kg左右), 每处理3个重复。采集的土样装于无菌塑料袋中, 带回实验室, 过2 mm筛, 自然风干后存于4 ℃冰箱中, 在4个月内处理完。

第2次于2014年12月, 即冬季, 按第1次的方法取样带回实验室, 并处理。

采用湿筛倾注-蔗糖离心法^[27]分离原始土样和培养物中的孢子。在体视显微镜下先观察孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等; 然后用微吸管挑取孢子置于载玻片上, 加水、乳酸、PVLG(聚乙烯醇-乳酸-甘油)和PVL(聚乙烯醇-乳酸酚)等作浮载剂, 封片后在显微镜下继续观察记录孢子的颜色、连孢菌丝的特征, 测定孢子的大小。压碎孢子后再观察内含物的性质、孢壁层次及各层颜色, 测定各层孢壁的厚度等。鉴定中辅助使用Me1zer’ s试剂^[28], 观察孢子的特异性反应, 对有代表性或特异性的特征随时进行拍照^{[29, 30]}。

综合以上观察结果, 根据Schenck 和 Pé ré z^[31]的及国际丛枝菌根保藏中心INVAM国际网站(http://invam.caf.wvu.edu/Myc-Info/)的分类描述, 并参阅有关鉴定材料和近年来发表的新种进行种属的检索和鉴定。

AM真菌种丰富度(species richness)^[22], 一个生境中物种数目的多寡, 本研究指一种宿主植物20 g根际土壤样本中的AM真菌种数。

AM真菌频度(frequency, F)^[22], 指某物种在样本总体中的出现率, 即:F=AM真菌某种出现次数/土壤总样本数× 100%。以种的频度作为划分优势种的标准, F> 50%为优势种, 30%< F≤ 50%为常见种, 10%< F≤ 30%为少见种, F< 10%为稀有种。

数据用SPSS (Version 17)统计软件进行方差分析, 用Duncan’ s新复极差法进行多重比较, 检验各处理平均值之间的差异显著性。

夏季不同耕作措施下共鉴定出AM真菌4属12种(表1)。其中, NT处理下, AM真菌多样性最高, 包括球囊霉属(Glomus)、多孢囊霉属(Diversispora)、巨孢囊霉属(Gigaspora)、盾巨孢囊霉属(Scutellospora)4个属, 共11个种; T处理下, AM真菌多样性最低, 包括球囊霉属和巨孢囊霉属2属, 共3个种; NTS处理下, 鉴定出球囊霉属、多孢囊霉属、巨孢囊霉属、盾巨孢囊霉属4个AM真菌属, 共9个种; TS处理下, 鉴定出球囊霉属、巨孢囊霉属、盾巨孢囊霉属3个AM真菌属, 共7个种。4个耕作措施下, 均鉴定出了球囊霉属和巨孢囊霉属。

冬季不同耕作措施下共鉴定出AM真菌3属11种(表1)。其中, NT处理下AM真菌多样性最高; T处理下AM真菌多样性最低, 包括球囊霉属、巨孢囊霉属2个属, 3个种。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 夏季和冬季不同耕作措施下的AM真菌种类 Table 1 AM fungi species under different tillage practices in summer and winter 属 Genus 种 Species 夏季 Summer 冬季 Winter 免耕 NT 耕作 T 免耕+秸秆 覆盖NTS 耕作+秸秆 覆盖TS 免耕 NT 耕作 T 免耕+秸秆 覆盖NTS 耕作+秸秆 覆盖TS 球囊霉属 Glomus 聚丛球囊霉 G. aggregatum + + + + + + + + 苏格兰球囊霉 G. caledonium + + + + + + + + 近明球囊霉 G. claroideum + + 缩球囊霉 G. constrictum + + 幼套球囊霉 G. etunicatum + + + + 地球囊霉 G. geosporum + + + + 摩西球囊霉 G. mosseae + + + + 根内球囊霉 G. intraradices + + + + 多孢囊霉属 Diversispora 沾屑多孢囊霉 D. spurcum + + 巨孢囊霉属 Gigaspora 易误巨孢囊霉 G. decipiens + + + 极大巨孢囊霉 G. gigantea + + + + + + + + 盾巨孢囊霉属 Scutellospora 美丽盾巨孢囊霉 S. calospora + + + + Note:+, species be occurred; NT, no-tillage; T, tillage; TS, tillage+stubble return; NTS, no-tillage+stubble return. 注:+, 发现该种; NT, 免耕; T, 耕作; NTS, 免耕+秸秆覆盖; TS, 耕作+秸秆覆盖。

表1 夏季和冬季不同耕作措施下的AM真菌种类 Table 1 AM fungi species under different tillage practices in summer and winter

与夏季相比, NT处理在冬季未分离到多孢囊霉属, 巨孢囊霉属在种的组成上也发生了变化, 未检测到易误巨孢囊霉(G. decipiens); T处理下的AM真菌, 无论是属的组成, 还是种的组成, 冬夏两季均无显著变化; NTS处理下, 冬季未分离到多孢囊霉属和巨孢囊霉属中的易误巨孢囊霉; TS处理下, 未分离到易误巨孢囊霉。

NT和NTS处理下, 夏季和冬季间AM真菌种丰富度差异显著(P< 0.05); T和TS处理下, AM真菌的种丰富度受季节变化影响较小(图1)。无论夏季还是冬季, NT处理下AM真菌种的丰富度最高, T处理最低, NT与NTS间均差异不显著(P> 0.05), 但显著高于T和TS(P< 0.05)。夏、冬季, 4种耕作措施下AM真菌的群落组成丰富度均表现为NT> NTS> TS> T。

图1

Fig.1

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	图1 夏、冬季不同耕作措施下AM真菌种丰富度Fig.1 Species richness of AM fungi under different agricultural farming practices in summer and winter

注:不同小写字母表示同一季节不同处理间差异显著(P< 0.05); * 表示同处理夏季和冬季间差异显著(P< 0.05)。

Note:Different lower case letters in the same season indicate significant difference among different treatments at 0.05 level; * , indicate significant difference for the same treatment between summer and winter at 0.05 level.

冬季与夏季相比, 一些种在群落组成中的分化等级发生了变化, 即AM真菌群落的结构发生了改变, 但变化不明显, 例如, 在夏季土样中, 易误巨孢囊霉为优势种, 沾屑多孢囊霉为常见种, 在冬季土样中却未发现(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 夏、冬季AM真菌的频度分级类 Table 2 Frequency classification of AM fungi in summer and winter 属 Genus AM真菌种 AM fungi’ s species 夏季 Summer 冬季 Winter 球囊霉属 Glomus 聚丛球囊霉 G. aggregatum A A 苏格兰球囊霉 G. caledonium A A 近明球囊霉 G. claroideum C C 缩球囊霉 G. constrictum C C 幼套球囊霉 G. etunicatum B B 地球囊霉 G. geosporum B B 根内球囊霉 G. intraradices B B 摩西球囊霉 G. mosseae B B 多孢囊霉属 Diversispora 沾屑多孢囊霉 D. spurcum B - 巨孢囊霉属 Gigaspora 易误巨孢囊霉 G. decipiens A - 极大巨孢囊霉 G. gigantea A A 盾巨孢囊霉属 Scutellospora 美丽盾巨孢霉 S. calospora B B 未鉴定出种 un-identified C C Note: A, dominant species; B, common species; C, rare species; -, species not be occurred. 注:A, 优势种; B, 常见种; C, 少见种; -, 没有发现该种。

表2 夏、冬季AM真菌的频度分级类 Table 2 Frequency classification of AM fungi in summer and winter

研究结果表明, 耕作措施显著影响了AM真菌的群落结构, 传统耕作较免耕会降低AM真菌的种丰度, 这一结果与Jansa等^[32]一致。引起这种变化的原

因主要有:1)耕作破坏了AM真菌的菌丝体; 2)耕作改变了土壤中的营养成分; 3)影响了微生物的活动; 4)杂草群落的改变^{[33, 34]}。球囊霉属和巨孢囊霉属AM真菌在耕作以及免耕土壤中均有存在, 因为球囊霉属对耕作干扰的耐受力较强, 且Boddington和Dodd^[35]认为耕作可以促进球囊霉属菌丝体的生长。耕作破坏了其它属的AM真菌繁殖生存的根外菌丝体以及孢子体, 并使其在土壤中消亡, 这也为球囊霉属减小了生存竞争^[33]。而巨孢囊霉属在耕作土壤中存在, 也许是由于试验土壤适宜与该属共生的植物生长。耕作+秸秆覆盖土壤中相较耕作土壤中, 发现了盾巨孢囊霉属AM真菌的存在, 因为秸秆覆盖改变了土壤的营养结构, 产生了更适宜盾巨孢囊霉属AM真菌生存的环境, 或是试验地的该类型土壤之前种植过适宜盾巨孢囊霉属AM真菌产生共生体的宿主植物, 孢子体又得以在适宜的土壤环境中生存以及繁殖。免耕+秸秆覆盖土壤中, AM真菌的群落组成类似于免耕土壤。不同的AM真菌会有不同的共生效力^{[34, 36]}, 因此AM真菌的群落结构也不尽相同^[33]。

无论是夏季还是冬季, 4种耕作措施下的AM真菌菌种的数量均表现为NT> NTS> TS> T, 冬季土壤与夏季土壤相比, 各耕作措施下AM真菌的属均未发生变化, 但种的组成发生了改变。冬季的土壤中, 各耕作措施下, 依旧表现为球囊霉属占最大比例, 这一结果也说明囊霉属适宜生存于各种生境。在免耕措施下, 夏季的土壤中共检出4属11种, 而冬季为3属9种, 冬季土壤中未有多孢囊霉属的AM真菌存在, 球囊霉属的根内球囊霉和巨孢囊霉属的易误巨孢囊霉也未检测到。这是由于冬季土壤温度低, 光合时间短, 用于作物光合作用的叶片数目也较少, 作物以及根系生长受到抑制^[37], 这便使得某些对寄主营养需求大的AM真菌的生长发育也受到抑制, 导致其频度降低, 从而改变了AM真菌的群落结构。传统耕作下, 冬夏季AM真菌的群落组成表现出类似的趋势, 只鉴定出2属3种, 为聚丛球囊霉、苏格兰球囊霉和极大巨孢囊霉, 说明这3种AM真菌在条件较恶劣的情况下也可以生存。4种耕作措施下, 冬季与夏季相比, 少了多孢囊霉属中的沾屑多孢囊霉, 巨孢囊霉属中的易误巨孢囊霉, 说明这两种AM真菌对温度和寄主的要求比较高。从冬、夏季AM真菌频度分级中发现, 易误巨孢囊霉和易误巨孢囊霉在夏季土样中为优势种, 在冬季土样中却未发现, 是因为在冬季, 这两种菌没有适宜生存的温度, 没有足够的赖以生存的光合产物, 而无法在土壤中存在。