为避免在提取血样时动物产生的应激性影响, 非损伤性取样法近年来越来越受到科学家们的关注。非损伤性取样方法, 是指动物在免受外界干扰或较低外界干扰的状况下, 收集其粪便、尿、唾液、羽毛、鳞片等样品的取样方法^{[4, 14]}。在非损伤性取样中, 唾液和尿液的采集通常需要对动物进行一定的处理, 过程比较复杂, 在实际操作中还会受到一定的限制^[7], 一般不采用。Sheriff等^[15]和Wasser等^[16]研究发现, 血液中的类固醇激素和粪便中的类固醇激素浓度存在很高的相关性, Risley等^[17]通过对豚尾猴(Macaca nemestrinal)粪便和血样中雌二醇和孕酮的测量发现, 二者存在很高的相关性, 这就使得可以通过粪便代替血液测定动物类固醇激素的水平。

对啮齿动物粪便类固醇激素研究的应用, 实现了粪样代替血样的激素分析方法。粪便样品的采集简单易行, 非损伤性取样方法可以避免采样过程中对动物正常生理活动的影响, 在啮齿动物生理生态研究中具有极为广阔的应用前景^{[4, 10, 11]}; 还可以避免啮齿动物产生应激反应而影响动物的内分泌水平^{[7, 18]}, 能够使啮齿动物在免受干扰或低干扰的情况下准确地测定各项类固醇激素的水平, 是比较理想的测定方法。另外, 相比于血液测定, 动物粪便中的类固醇水平可以代表动物在一段时间内的类固醇激素水平^[18], 因此, 可以通过粪便测定啮齿动物一段时间内的类固醇水平, 研究其类固醇水平的动态变化。同时, 利用动物粪便测定动物的类固醇激素及其代谢产物对野生动物的保护具有重要意义^[2]。目前, 对粪便中类固醇激素的研究日益广泛。

在啮齿动物粪便类固醇激素的研究中, 粪便样品的采集和保存对粪便类固醇的测定具有重要影响。相比于在血液类固醇激素测定过程中血样的采集与保存, 粪便样品的采集与保存显得更为简单, 容易进行。但是已有研究发现, 粪便内部及其周围环境中的细菌、酶类等物质都会降解粪便类固醇激素中的代谢产物^{[16, 19, 20]}, 同时, 在其野外环境中, 雨淋或日晒等外界自然因素也会影响粪便中类固醇激素水平^{[1, 21]}, 使粪便中的类固醇激素水平发生变化。故采集的粪便样品的新鲜程度以及对其进行合理的保存具有十分重要的作用。目前, 研究者主要以粪便表面的黏膜是否干燥为依据判断粪便的新鲜程度^[22]。采集的新鲜粪样, 通常使用叠氮化钠或乙醇等防腐剂来保存, 防止细菌的生成, 影响粪便类固醇激素的水平^[2]。于小杰等^[23]研究发现, 粪团表层与粪团内部的类固醇激素含量存在显著差异, 故在取样时需要将粪样充分混合均匀。为了使试验结果更加准确可靠, 必须对样品进行合理的采集与保存。

采集的新鲜粪便要及时进行保存, 使试验测定结果更加准确可靠。现如今最常见的保存方法主要有:

1)冷冻保存法, 是指将采集的新鲜粪便样品置于-20 ℃的冰箱中冷冻, 通过液氮、干冰等冷冻方式运至实验室后, 再在-20 ℃下保存的方法^[1]。在C18试剂盒中, 类固醇的提取和储藏在-20 ℃下可以延长两周^[24]。Frynta等^[10]将非洲刺毛鼠(Acomys chirinus)的样品在-20 ℃下冷冻保存。根据不同的试验要求及条件, 也有些研究在其他温度范围内保存^{[19, 24]}, 陈万东等^[25]将黑线姬鼠(Apodemus agrarius)的粪样自然干燥后在-30 ℃下保存待用。液氮保存法是一种比较好的保存方法, 但是在野外没有足够的液氮, 这一方法并不适用^{[2, 16]}。冷冻保存法一般用于圈养动物粪便类固醇的保存^{[4, 16]}, 在野外条件下通常不具备制冷设备, 无法进行远距离或长时间的冷冻保存^{[4, 19]}, 受到一定的限制。

2)有机溶剂保存法。有机溶剂可以限制细菌的生成, 在一定程度上可以杀死细菌, 抑制酶的活性。目前, 在大多数粪便类固醇激素的研究中, 都是保存在乙醇中, 通过研究发现, 在室温下乙醇能够在21 h内杀死细菌, 大大地降低酶的活性^[16]。在有些研究中, 采用了有机溶剂与冷冻相结合的保存方法, 取得了很好的成效^[2]。在使用有机溶剂保存时, 需要注意有机溶剂的用量及浓度。在不同的研究中, 有机溶剂的用量及浓度要求不同, 同种溶剂对不同类固醇激素的保存时间也不同^{[1, 4, 19]}。而且, 有机溶剂会改变部分类固醇激素的结构, 在运输过程中也会受到限制^[1], 故这种方法一般不采用。

3)干燥保存法, 是将粪便去除杂质后在烘箱中烘干保存的方法, 该方法简单, 容易操作, 烘干样也变于携带, 是比较理想的保存方法。付慧等^[26]将小鼠(Mus musculus)粪便冷冻干燥保存, 测定其粪样中的胆固醇含量。Galama等^[27]研究发现, 烘干的黑犀牛(Diceros bicornis)的粪样中类固醇激素可以保存180 d。但是, 烘干的最佳温度和时间会影响测定结果准确性^{[1, 4]}, 难以把握, 增加了该种保存方法的难度; 其次, 烘干保存法中烘箱不可缺少, 在野外测定时大多都不具备烘箱。因此, 这种保存法在具体的试验过程中也受到一定的限制。

以上3种方法各有利弊(表1)。具体试验过程中, 需要根据不同的试验要求及条件选择不同的保存方法, 也可以将其中两种方法结合使用, 确保测定结果的准确性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 动物粪便样品3种保存方法比较 Table 1 Comparison of three storage methods on fecal steroids 保存方法 Storage method 优点 Advantage 缺点 Disadvantage 适用范围 Range of application 参考文献 Reference 冷冻保存法 Freezing method 效果最好 Best effect 设备要求高 High demand of equipments 短距离保存 Short distance to save [4, 19, 24] 有机溶剂保存法 Organic solvent method 抑制微生物活性 Restrain activity of microorganisms 保存时效短 Save the time short 短距离保存 Short distance to save [1, 16] 干燥保存法 Drying method 便于携带 Easy to carry 最佳干燥温度和时间尚不确定 The best drying temperature and time are uncertain 室内 Indoor [1, 4]

表1 动物粪便样品3种保存方法比较 Table 1 Comparison of three storage methods on fecal steroids

目前, 对动物粪便类固醇及其代谢产物的分析方法已有很多报道。不同动物种类的粪便类固醇及其代谢物的含量不同, 不同的测定方法所测定的结果也不同。因此, 需要根据不同的试验要求和试验条件的限制选择不同的试验分析方法。最常用的粪便类固醇激素的测定方法主要包括放射性免疫分析法、酶联免疫分析法和高效液相色谱分析法(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 鼠类粪便内固醇测定方法比较 Table 2 Comparison of assay methods in rats’ fecal steroids 测定方法 Assay method 优点 Advantage 缺点 Disadvantage 鼠种 Rat 参考文献 Reference 高效液相色谱分析 HPCL 能同时测定各类固醇激素 Can identify all the fecal steroids 不宜在野外、灵敏度低 No suitable in the field, and low sensitivity 家鼠Mus musculus、黑线姬鼠Apodemus agrarius [9, 34] 放射免疫分析 RIA 可信度高 High reliability 交叉反应、辐射 Cross reaction and radiation 红背田鼠Clethrionomys gapperi、 鹿鼠Peromyscus maniculatus [12] 酶联免疫吸附测定 ELISA 简单、安全 Easy, safe 灵敏度低、交叉反应 Low sensitivity and cross reaction 黑鼠Rattus rattus [30]

表2 鼠类粪便内固醇测定方法比较 Table 2 Comparison of assay methods in rats’ fecal steroids

在不同的试验过程中, 所测得的粪便类固醇激素的含量不同, 因此, 在进行结果分析时, 还需考虑影响粪便中类固醇激素含量各种因素。粪便类固醇激素除受到粪便新鲜程度、微生物和周围环境因素的影响影响外^[17], 还受动物种类、粪便在肠道内的滞留时间、节律性、动物的食性等方面因素的影响。不同物种的粪便中, 类固醇激素及其代谢产物的含量变化很大^[2]; 粪便中的类固醇激素滞后于血液中的内固醇激素, 不同物种, 滞后时间不同。研究发现, 鼠类粪便中的类固醇激素相比于血液中的类固醇激素, 滞后9~10 h^[9]; 对于啮齿类等夜行性动物, 类固醇激素分泌的高峰期多在傍晚, 为避免昼夜节律对粪样中内固醇激素含量的影响, 其粪样的采集需在暗光下进行^[34]; 此外, 粪便中的各种激素也会受到季节的影响^[1]。鹿鼠粪便中的类固醇激素的含量8月和9月明显高于7月与10月^[12]。啮齿动物属于植食性动物, 在采食过程中, 食物中纤维素的含量会影响其粪便中内固醇的含量, 随着季节的不同, 食物中的纤维素含量不同^[35]; 为了使测定结果更为准确可靠, 样品必须混和均匀后进行分析测定^[1]; 同时, 还受到样品量、性别、年龄、生殖状态、适应性等因素的影响。

近年来, 对啮齿动物粪便类固醇的研究日益广泛。Touma等^[7]研究证明, 外界干扰会使鼠类粪便中类固醇含量升高。Harper和Austad^[12]通过谢尔曼陷阱捕获测定鹿鼠的应激反应, 鹿鼠在陷阱中的时间越长, 其粪便类固醇的增加越显著。故可通过粪便类固醇激素及其代谢产物水平测定动物的应激反应状态。Touma等^[9]研究发现, 雄性家鼠粪便中的皮质酮浓度/含量显著高于雌性家鼠。Pihl和Hau^[30]同样也得出雄性黑鼠粪便中的皮质酮含量高于雌性黑鼠; 动物的繁殖行为靠内分泌系统的调控, 主要是通过性腺和肾上腺分泌的性腺激素和皮质激素来调控的。Kersey等^[36]的研究表明, 粪便雌激素和孕激素能够反映其繁殖状态; 刁晓平等^[37]的研究也同样证实了这一现象。何慧等^[38]研究发现, 根田鼠(Microtus oeconomus)粪便皮质酮含量有明显的昼夜节律性, 最高峰出现在08:00和24:00, 最低峰出现在12:00和16:00, 以及急性应激后与慢性应激期间粪便皮质酮含量明显增加。

动物粪便类固醇激素的研究对动物生理繁殖、压力反应的测定、种群性别诊断等方面具有重要意义^{[4, 22, 39, 40, 41]}。动物的行为与其内分泌水平息息相关^[42], 可以测定动物肾上腺皮质激素状态的各种指数^{[19, 43]}。在哺乳动物中, 可以通过对其生殖激素的测定来判断野生或圈养动物的卵巢功能^[28]。综上所述, 对啮齿动物粪便类固醇的研究, 可以实现对啮齿动物应激反应、性别、繁殖状态、孕期等方面的监测, 在一定程度上为啮齿动物鼠害的防治提供有效的方法。

综上所述, 啮齿动物粪便类固醇激素的研究对衡量啮齿动物生理机制及生理平衡等方面具有重要意义。传统的血液测定法, 在样品的提取过程中难免会对动物产生各种干扰, 使动物产生应激反应, 导致体内类固醇激素的代谢相应的发生改变, 影响测定结果的准确性, 而且, 血液中测得的类固醇含量是动物在某一时刻的类固醇激素水平, 不能满足动物长时间类固醇激素水平的监测。相比于血液测定法, 粪便类固醇激素的测定作为一种非损伤性测定法具有无法比拟的优点, 粪便样品采集在不干扰动物的情况下就可以进行, 不会使动物产生应激反应, 同时, 粪便类固醇激素及其代谢物的含量是动物在某一时间段的类固醇激素及其代谢物的含量。如今, 啮齿动物粪便类固醇激素及其代谢产物的测定对啮齿动物健康状况的评估、适应性测定、行为监测、性别诊断、生殖生理监测等方面的应用显得日益重要。

但是, 对啮齿动物粪便类固醇激素的测定目前还存在着一定的局限性。在实际操作中需要引起注意。试验过程中, 受野外试验条件的限制, 在粪样的保存和运输过程中粪便类固醇激素含量会发生不同程度的变化, 可能影响测定结果的准确性。不同动物种、种群之间, 粪便类固醇激素的代谢物不同^[1], 在采用免疫法测定时, 需选择特定的抗体测定^[37]。试验开始前, 先确定待测样品, 因为有些抗体能与样品中其他类固醇或代谢物发生交叉反应, 而有些特异性较高, 不会与其他类固醇激素发生交叉反应, 而且在不同研究中交叉反应不同^[2]。因此, 在分析试验时需要考虑研究中交叉反应。此外, 在测定过程中还需要注意粪便中的类固醇在肠道内的停留时间, 不同物种, 滞后时间不同。

总之, 对啮齿动物粪便类固醇激素的研究方法目前还不够完善, 但是其所具备的种种优点, 使得粪便类固醇激素的研究仍受亲睐, 相信通过不断的发展与完善, 会逐渐得到改进与提高, 为更多的研究者提供参考借鉴。