试验材料为2014年6月采自青藏高原东部高寒草甸常见的毛茛科植物钝裂银莲花, 采样地位于甘肃省的玛曲(101° 53' E, 35° 58' N), 地处青藏高原东北缘, 平均海拔3 500 m, 年平均气温1.2 ℃, 月均温从1月的-10 ℃到7月的11.7 ℃, 年降水量620 mm, 植被类型属高寒草甸^[15], 黄色的、浅黄色的花居多。采回花瓣, 去除花蕊群, 避免花瓣沾染花粉; 80 ℃杀青30 min, 然后60 ℃烘干粉碎成末, 装于自封袋避光干燥保存^[19]。

1.2.1 钝裂银莲花花色素的定性分析 取不同花色花瓣粉末各0.100 g, 放入具塞试管中, 分别加入30.0%氨水、10.0%盐酸和石油醚各5 mL, 静置, 2 h后观察颜色变化并记录^[20]。

1.2.2 黄酮类化合物的检测 取供试材料0.100 g, 采用1%盐酸化甲醇溶液(盐酸和甲醇体积比为1:99), 分别避光浸提24 h, 然后过滤并定容到25 mL, 此作为测试液。取上述测试液各2 mL进行以下显色反应^{[20, 21]}:(1)浓盐酸―镁粉反应:先加入少许镁粉, 再加入浓盐酸5滴, 摇匀后静置1 h; (2)乙酸铅反应:加2 mL 1.0% Pb (CH₃COO)· 3H₂O, 摇匀后静置1 h; (3)三氯化铝反应:加1 mL 1.0% AlCl₃· 6H₂O甲醇溶液, 摇匀后静置1 h; (4)三氯化铁反应:加2 mL 5.0% FeCl₃· 6H₂O, 摇匀后静置1 h; (5)浓硫酸反应:加浓H₂SO₄ 1.5 mL, 小心摇匀后沸水浴5 min; (6)碳酸钠反应:加3 mL 5% Na₂CO₃ 溶液, 密闭摇匀后静置30 min, 最后通空气10 min; (7)硼酸反应:加1.0% H₂O₂C₄· 2H₂O 10滴, 再加2.0% H₃BO₃ 3 mL; (8)氯化锶反应:在测试液中先加入10滴0.01 mol· L^-1 SrCl₂· 6H₂O甲醇液, 再加10滴被氨水饱和的甲醇液(10 mL甲醇溶液, 加氨水定容至25 mL), 摇匀后静置1 h。

1.3.1 叶绿素光谱分析 称取两种花色花瓣粉末各0.100 g, 用乙醇和丙酮混合溶液(体积比为1:9)提取, 定容至10 mL, 用UV-3000型紫外-分光光度计在200-700 nm内扫描, 比色皿光径1 cm^[19]。

1.3.2 类胡萝卜素光谱分析 称取两种花色花瓣粉末各0.100 g, 用石油醚和丙酮混合液(体积比为1:1)提取, 定容至10 mL, 用UV-3000型紫外-分光光度计在200-700 nm内扫描, 比色皿光径1 cm^[19]。

1.3.3 黄酮类化合物光谱分析 取1.2.2步骤中测试液, 用UV-3000型紫外-分光光度计在200-700 nm内进行扫描, 比色皿光径1 cm^[22]。

由1%盐酸甲醇浸提得到的提取液, 用UV3000型紫外分光光度计进行400―600 nm范围内扫描, 测得两种花色钝裂银莲花花色素吸收峰在535 nm处, 符合花色苷特征吸收^{[7, 23]}。

1.4.1 pH值稳定性试验 按参照文献[24]配制0.1 mol· L^-1柠檬酸、0.2 mol· L^-1磷酸氢二钠, 得到pH为2~6的缓冲液, 由配置的0.05mol· L^-1硼砂、0.2 mol· L^-1硼酸溶液, 得到pH 7~9的缓冲溶液, 然后取5 mL花色素原液于10 mL试管中, 加入不同pH值的溶液。静置2 h后, 观察不同pH值色素溶液的颜色变化, 以花色素原液为对照, 测定535 nm处的吸光度。

1.4.2 金属离子稳定性试验 分别配制含有0.1 mol· L^-1的K⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺溶液, 分别取6 mL花色素提取液, 加入各金属离子溶液1 mL, 静置1 h后观察颜色变化, 1%盐酸甲醇为空白, 测定535 nm处的吸光度。

1.4.3 光稳定性试验 两种花色钝裂银莲花分别分装12份, 每份取6 mL; 6份置于自然光照(25 ℃), 6份置于黑暗(25 ℃)。分别在0、2、4、6、8、10、12 d后, 观察颜色变化, 并以1%盐酸甲醇为空白, 检测535 nm处的吸光度。

利用Excel进行数据基础处理, 对花色素稳定性研究中, 用SPAA 20.0对试验结果进行单因素方差分析和独立样本T检验。

2.1.1 盐酸-镁粉反应 反应出现不同程度红色(表2), 说明钝裂银莲花花色素可能含有黄酮醇(Flavonols)、二氢黄酮醇(Flavanonols)、二氢黄酮(Flavanones)、花色苷, 可能含异黄酮(IsonaVones); 在其对照为阳性, 可能含有查耳酮(Chalcones)^{[9, 25]}。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 花色素显色反应 Table 2 Color reaction of flavonoids in Anemone obtusiloba 反应溶液 Reaction solution 花色Flower color 黄色Yellow 浅黄色Pale yellow 盐酸-镁粉(对照CK)HCl-Mg 红(淡红)Red(Pale red) 淡红Pale red(极淡红) 醋酸铅Pb(CH3COO)· 3H2O 淡红, 有白色沉淀 Pale red, white precipitate 淡红, 有白色沉淀 Pale red, white precipitate 三氯化铝AlCl3· 6H2O 淡橙色Pale orange 极淡橙色Pale orange 浓硫酸H2SO4 橙黄Yellow orange 橙黄Yellow orange 碳酸钠Na2CO3 黄Yellow 黄Yellow 硼酸H3BO3 淡红Pale red 红Red 氯化锶SrCl2 绿, 有褐色沉淀 Pale green, brown precipitate 绿, 有褐色沉淀 Pale green, brown precipitate 三氯化铁FeCl3 墨绿Dark green 墨绿Dark green

表2 花色素显色反应 Table 2 Color reaction of flavonoids in Anemone obtusiloba

2.1.2 中性醋酸铅反应 显不同程度淡红并都伴有白色沉淀(表2), 表明该黄酮类化合物具有邻二酚羟基或兼有4-酮基、3-OH或4-酮基、5-OH结构^{[9, 26]}。

2.1.3 三氯化铝反应 反应出现不同程度黄色(表2), 说明含有黄酮、黄酮醇、查耳酮, 异黄酮, 不含有二氢黄酮^[19]。

2.1.4 浓硫酸反应 出现不同程度橙黄色(表2), 煮沸5 min颜色不变色。表明含有黄酮、黄酮醇、异黄酮和花色素苷; 可能含有查耳酮, 不含橙酮、二氢黄酮^[27]。

2.1.5 碳酸钠反应 均出现黄色(表2), 通气后不变色说明不含二氢黄酮、查耳酮、橙酮; 但是两种测试液中出现黄褐色结晶沉淀, 此现象有待进一步探究。

2.1.6 硼酸反应 显不同程度红色(表2), 说明该花色素中可能具备5-羟基黄酮或2-羟基查耳酮类化合物^[28]。

2.1.7 氨性氯化锶反应 均显淡绿色且伴有棕色沉淀(表2), 表明黄酮类化合物具有邻二酚羟基结构^[20]。

2.1.8 三氯化铁反应 均出现墨绿色(表2), 说明钝裂银莲花花色素中含有酚羟基结构, 花色素可能具备3', 4', 5'-3-羟基基团^{[19, 20]}。

紫外-可见光谱分析(图1)发现, 钝裂银莲花花瓣的丙酮和石油醚(体积比为1:1)提取液在442和468 nm处均吸收峰出现, 符合胡萝卜特征吸收曲线, 说明含有类胡萝卜素; 在90%丙酮溶液光谱扫描中, 在660-680 nm处均出现特征吸收峰, 说明其花色素还含有叶绿素; 234-278 nm(区带2)和300-369 nm(区带1)处具有特征吸收峰, 并且区带2比较明显, 说明钝裂银莲花花色素含有黄酮类化合物; 并且在530-535 nm处出现的特征吸收峰说明该花色素还含有花色苷^[22]。

图1

Fig.1

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	图1 花色素紫外-可见分光光谱分析Fig.1 The UV-visible spectra of petal pigments in Anemone obtusiloba

2.3.1 pH值对花色的影响 在pH 2~7时, 随着pH值不断增大, 花色素吸光度呈下降趋势, 其吸光度下降74.07%, 浅黄花下降69.44%, 黄花测试液由紫红色趋于淡黄色, 浅黄花则是由洋红变为无色(表3); pH 8~9时花色苷吸光度先升高再降低, 具有一定的波动性; 总体而言, 两种花色钝裂银莲花花色素性质偏酸性。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 pH值对花色素稳定性的影响 Table 3 Effects of pH on stability of anthocyanin pH 黄花Yellow 浅黄花Pale yellow 吸光度Absorbance 显色Visualisation 吸光度Absorbance 显色Visualisation CK 0.139 6Aa 淡紫红Purple red 0.231 7Aa 洋红Carmine 2 0.077 1Ab 极淡紫红Light purple red 0.141 4Ab 粉红Pink 3 0.074 3Ab 淡红Light red 0.139 5Ab 粉红Pink 4 0.065 1Ac 浅黄Pale yellow 0.125 4Ac 无色Colourless 5 0.055 9Bc 浅黄Pale yellow 0.114 3Ac 无色Colourless 6 0.043 6Bc 浅黄Pale yellow 0.102 4Ac 无色Colourless 7 0.036 2Ac 浅黄Pale yellow 0.070 8Ac 无色Colourless 8 0.074 3Ab 淡红Light red 0.135 7Ab 粉红Pink 9 0.055 4Ac 浅黄Pale yellow 0.081 7Ac 无色Colourless Note:Different capital letters indicate significant difference between the two colors at 0.05 level, and different lower case letters indicate significant differences among different pH at 0.05 level. 注:不同大写字母表示两花色间显著性差异(P< 0.05), 不同小写字母表示各pH间差异显著(P< 0.05)。

表3 pH值对花色素稳定性的影响 Table 3 Effects of pH on stability of anthocyanin

2.3.2 金属离子对花色素的影响 大多数金属离子对花色苷的稳定性影响不明显(表4); 而Fe³⁺和Cu²⁺对两种花色素苷稳定性影响显著, Fe³⁺对黄花和浅黄花花色素吸光度分别比对照提高了117.4%和22.0%, 呈正相关, 而Cu²⁺使黄花和浅黄花花色素的吸光度比对照分别减小了11.1%和54.1%, 呈负相关。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 金属离子对花色素稳定性的影响 Table 4 Effects of mental on stability of anthocyanin 金属离子 Ion 花色Flower color 黄色Yellow 浅黄色Pale yellow CK 0.248 2Bc 0.343 5Bb Fe2+ 0.539 7Aa 0.418 9Ba Na+ 0.304 4Ab 0.274 1Ab Mn2+ 0.302 4Ab 0.272 7Ab Mg2+ 0.299 3Ab 0.278 7Ab Ca2+ 0.298 7Ab 0.277 3Ab Al3+ 0.296 9Ab 0.282 4Ab K+ 0.294 2Ab 0.270 1Ab Cu2+ 0.221 1Ac 0.158 0Bc Note:Different capital letters indicate significant difference between the two colors at 0.05 level, and different lower case letters indicate significant difference among different mentals at 0.05 level. 注:不同大写字母表示两花色间显著性差异(P< 0.05), 不同小写字母表示不同金属离子间差异显著(P< 0.05)。

表4 金属离子对花色素稳定性的影响 Table 4 Effects of mental on stability of anthocyanin

2.3.3 花色素的光稳定性 随着光照天数的增加, 两种花色钝裂银莲花花色素吸光度都呈先剧烈后缓慢的下降趋势, 12 d时, 黄花花色素和浅黄花花色素吸光度分别下降92.1%和93.7%(图2); 在黑暗条件下, 黄花和浅黄花花色素吸光度下降较光照平缓, 黄花和浅黄花分别下降27.2%和22.2%。这说明该花色素适合在暗环境中保存。在光照和黑暗处理下, 黄色花和浅黄花的稳定性差异较明显。

图2

Fig.2

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	图2 光照对花色素稳定性的影响Fig.2 Effects of light on stability of anthocyanin